微生物检测过程中出现污染的原因分析及处理

微生物检测是食品安控、医药研发及环境监测的核心技术支撑，其结果准确性直接关联决策的科学性。但检测全流程中，污染问题常导致数据偏差、实验重复率低，甚至引发错误结论。本文聚焦微生物检测各环节的污染成因，从样本采集、环境控制到操作细节逐一拆解，并提供针对性处理方案，助力实验室提升检测可靠性。

样本采集与预处理的污染隐患

样本采集是检测第一步，也是污染高发环节。部分实验室为便捷使用未灭菌的采样工具（如塑料勺、不锈钢刀），或采样袋未按要求环氧乙烷灭菌，工具表面残留菌直接污染样本。例如，采集固态食品时，未灭菌的采样勺可能附着枯草芽孢杆菌，混入样本后掩盖目标菌数量。

采样过程交叉污染常见。同一区域采集多样本时，未更换手套或擦拭工具，前一样本菌会带入后一样本；或样本暴露空气超过10分钟，空气中浮游菌（如金黄色葡萄球菌、曲霉）沉降至表面。某乳品厂采样时，敞口采样杯放置车间内，酵母菌混入导致“乳酸菌数”超标。

预处理不当也会污染。稀释液过期或未灭菌（如放置超7天的生理盐水），内部易滋生大肠埃希菌；均质时用非无菌袋，袋壁裂缝让外界菌渗入；稀释震荡产生的气溶胶，可漂浮至其他样本或试剂表面，形成隐性污染。

实验环境的可控性缺失

无菌室洁净度不达标是关键问题。部分实验室未定期检测沉降菌（GB/T 16294-2010要求百级区沉降菌≤1 CFU/Φ90mm平皿·0.5h），若空调高效过滤器堵塞漏风，外界含菌空气会进入。某医院检验科无菌室3个月未换过滤器，沉降菌达12 CFU/平皿，导致尿液培养全部污染。

人员操作不规范加剧风险。实验人员穿普通白大褂、戴普通手套进入无菌室，未戴无菌帽或面罩，头发、面部皮屑菌（如表皮葡萄球菌）易脱落污染；或未风淋，衣物灰尘带菌进入。超净工作台使用也有漏洞：紫外灯未开够30分钟，或工作时开侧窗，外界空气破坏无菌环境。

台面清洁不到位同样隐患。前次实验残留的培养基或样本未用75%酒精擦拭，滋生的杂菌会污染后续样本。某食品实验室台面残留大肠杆菌培养液未清理，导致后续沙门氏菌检测均检出大肠杆菌，实验失败。

试剂与耗材的质量把控漏洞

培养基灭菌不彻底是试剂污染主因。部分实验室高压灭菌参数错误：如培养基体积超500ml仍按20分钟灭菌，内部温度未达121℃；或灭菌后未及时冷却，40℃以上放置过久，易被空气中芽孢杆菌污染。某实验室营养琼脂用121℃15分钟灭菌（标准20分钟），结果长出大量蜡样芽孢杆菌。

一次性耗材无菌性不达标也常见。部分厂商培养皿、移液管标注“无菌”，但环氧乙烷浓度不足或解析时间不够，残留菌未杀灭；或开封后24小时未用，受潮滋生霉菌（如黑曲霉）。某实验室用开封3天的培养皿，平板出现成片霉菌，经查是受潮后霉菌孢子污染。

试剂配制污染不可忽视。配置磷酸盐缓冲液用未灭菌自来水，水中微生物（如细菌、草履虫）直接进入；染色液未密封，空气中菌落入染液，染色时污染样本。

操作流程的人为误差

接种操作不规范是人为污染核心。接种环未烧至红热或灼烧后未冷却（需30秒），残留菌未杀灭或高温烫死目标菌，同时气流带入空气菌。例如，接种大肠杆菌时，未冷却的接种环挑菌，平板未长目标菌却出现葡萄球菌。

移液细节失误引发污染。移液枪头未插紧，吸样时吸入外界空气带菌；或枪头碰到试管口外壁（虽经火焰灼烧，外壁仍可能残留菌），杂菌进入移液管。某实验移取沙门氏菌时，枪头碰未灭菌试管架，平板出现与架面一致的杂菌。

倒平板与涂布问题。培养基温度超50℃倒平板，底部冷凝水流动带空气菌至表面；或洒到边缘未清理，边缘菌扩散至整个平板。涂布时，涂布器未酒精灼烧或未冷却，烫死平板菌同时残留菌污染。

气溶胶传播的隐性污染

气溶胶是易忽视的污染途径。处理样本（均质、振荡、移液）时，液体形成≤10μm的气溶胶颗粒，悬浮数小时，接触样本或试剂即污染。某实验室无生物安全柜均质生鸡肉，产生的沙门氏菌气溶胶污染相邻空白平板。

离心操作也产气溶胶。离心管未盖紧或离心后开盖，液体溅出形成气溶胶。某实验离心大肠杆菌时，管盖松动，开盖瞬间气溶胶扩散，导致后续实验均检出大肠杆菌。

预防需在生物安全柜中进行气溶胶操作，其高效过滤器过滤99.97%的0.3μm颗粒；操作后关柜门，开紫外灯30分钟灭菌。人员需戴N95口罩，避免吸入。

仪器设备的维护漏洞

高压灭菌锅性能异常是关键。部分设备温度探头不准，显示121℃实际仅115℃，导致灭菌不彻底。某实验室灭菌锅探头偏差6℃，营养琼脂中存活枯草芽孢杆菌，平板长出大量菌落。

恒温培养箱清洁不到位。箱内残留培养基或样本未清理，滋生的菌污染后续实验。某实验室箱内残留霉菌培养基，未清理导致后续细菌平板长霉菌。

超净工作台风速不足。风速需0.36-0.54m/s，若风机故障降至0.2m/s，无法阻挡外界空气，导致污染。某工作台风速不够，平板出现空气杂菌。

污染后的即时处理策略

发现污染先定位源：若所有平板有相同杂菌，可能是培养基或试剂问题；若个别平板，可能是操作或采样问题。观察杂菌形态（如霉菌或细菌），结合流程记录追溯。

隔离污染物品：污染样本、试剂用双层袋封存标注，高压灭菌后丢弃；污染仪器（如超净台、培养箱）立即停止使用，彻底消毒。

环境消毒：无菌室用2%过氧乙酸喷雾（每立方米8ml），关窗1小时后通风；超净台用75%酒精擦台面，开紫外灯30分钟；高压灭菌锅做生物监测（用嗜热脂肪芽孢杆菌孢子片）确认参数。

验证流程：处理后用无菌水做空白对照，确认无杂菌后重新检测，确保环节无问题。