药品中大肠杆菌微生物检测的分离培养步骤要求

大肠杆菌是药品微生物污染的重要指示菌，其存在提示药品可能受粪便污染或生产卫生控制不足。分离培养是药品中大肠杆菌检测的核心环节，直接决定结果的准确性。本文围绕药品中大肠杆菌微生物检测的分离培养步骤，详细阐述样品处理、培养基选择、接种增菌、分离操作及无菌要求等关键内容，为实验室规范检测提供实操指引。

样品处理的形态适配要求

药品形态差异大（固体、液体、膏剂等），需针对性处理以释放大肠杆菌并避免损伤。固体药品（如片剂、粉剂）取10g，加90ml含0.1%聚山梨酯80的无菌生理盐水，用匀浆机均质2-3分钟制成1:10匀悬液；难溶样品可加0.5%聚山梨酯80，或40-45℃水浴辅助分散，但温度需严格控制防止灭活。

液体药品（如口服液、注射剂）取10ml加90ml无菌稀释液混匀；若含防腐剂（如苯扎溴铵），需加对应中和剂（如吐温-80），中和剂种类与浓度需验证确认。

膏剂/半固体药品（如软膏）取10g，加含0.1%聚山梨酯80的生理盐水90ml，搅拌至均匀，必要时45℃水浴5分钟助溶，冷却后使用。样品处理后2小时内完成接种，若需暂存需4℃冷藏且不超过2小时。

培养基的选择与性能验证

大肠杆菌分离培养需“增菌+选择性鉴别”两步培养基。增菌首选胆盐乳糖培养基（BL）：胆盐抑制革兰阳性菌，乳糖为大肠杆菌提供碳源，溴甲酚紫指示产酸（变黄则提示可能有大肠杆菌）。制备时需121℃高压灭菌15分钟，冷却至45℃备用。

选择性鉴别用麦康凯琼脂或伊红美蓝琼脂（EMB）。麦康凯以胆盐、结晶紫抑制革兰阳性菌，乳糖+中性红指示产酸（红色菌落为大肠杆菌）；EMB以伊红、美蓝为指示剂，大肠杆菌发酵乳糖产酸形成紫黑色带金属光泽菌落。两种培养基均需121℃灭菌15分钟，倒平板前需冷却至50℃左右，避免琼脂凝固不均。

培养基需做适用性检查：接种大肠杆菌标准株（ATCC 25922），培养后观察生长情况与菌落形态，确保选择与鉴别功能正常；若出现杂菌过度生长或菌落形态异常，需重新制备。

接种与增菌的参数控制

增菌是富集大肠杆菌的关键步骤。取处理后的1:10匀悬液1ml，加入9ml BL增菌液（体积比≥9:1，维持选择压力），轻轻混匀避免气泡。增菌温度36±1℃，时间18-24小时：时间不足则菌量不够，超过24小时杂菌可能繁殖。培养后若BL液变黄，需继续下一步；若仍为紫色，可延长至48小时但需结合后续结果判断。

若样品含菌量极低（如注射剂），可增加接种量至2ml，但需保证增菌液体积足够（如18ml BL液+2ml样品），避免稀释度过低影响选择效果。

分离划线的操作细节

增菌后需通过划线分离单菌落。操作前超净台紫外消毒30分钟，75%乙醇擦台面与双手。用无菌接种环挑取增菌液一环，在麦康凯或EMB平板做“三区划线”：第一区密集划1/4面积，第二区从第一区末端挑菌斜划1/3面积，第三区从第二区末端稀疏划剩余区域，确保单菌落形成。

划线力度需轻柔：接种环与平板呈45°角，避免划破琼脂；每划完一区，接种环需灼烧灭菌（冷却后）再划下一区，防止交叉污染。平板需倒置培养（避免冷凝水冲散菌落），温度36±1℃，时间18-24小时。

可疑菌落的挑选与纯培养

培养后需按形态挑取可疑菌落：麦康凯上选红色、圆形、光滑、边缘整齐的2-3mm菌落；EMB上选紫黑色带金属光泽的1-2mm菌落。挑取2-3个典型菌落（避免漏检），用接种环从菌落中心取少量菌，接种至营养琼脂斜面（沿斜面底部向上划直线）。

纯培养条件同增菌（36±1℃，18-24小时），培养后斜面需长满均匀灰白色菌落：若出现不同形态菌落（如黄色、不规则），说明有杂菌，需重新划线分离；若生长均匀，则为纯培养物，可用于后续生化鉴定。

无菌操作的核心控制点

无菌操作是结果准确的前提。超净台需提前30分钟开紫外+风机，操作前关闭紫外，用75%乙醇擦台面、双手及接种环；接种环每次用前灼烧至红热，冷却30秒后使用（避免烫死菌）；吸管、培养皿、培养基需121℃灭菌15分钟，使用时用无菌镊子夹取；操作中避免说话、咳嗽，减少空气流动；培养皿需倒置存放，防止冷凝水污染；实验结束后，用过的器具需高压灭菌，台面用75%乙醇擦拭，超净台开紫外消毒30分钟。

分离培养的常见问题与解决

若分离平板无红色/紫黑色菌落，需检查：样品处理是否充分（如固体未均质）、增菌时间是否足够（可延长至48小时）、培养基是否失效（如BL液未变黄）；若出现大量杂菌，需检查无菌操作（如接种环未灭菌）、培养基选择是否正确（如用了无选择作用的营养琼脂）；若菌落形态不典型（如麦康凯上出现粉色菌落），需重新挑取接种纯培养，结合生化试验确认。

另外，需注意不同药品的特殊要求：如含油脂的软膏需用石油醚脱脂（再用生理盐水洗涤），含糖分的口服液需增加BL液中胆盐浓度（防止酵母菌生长），确保分离培养不受样品基质干扰。