转基因成分鉴定中EPSPS基因检测的标准操作规范

EPSPS（5-烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶）是抗草甘膦转基因作物的核心功能基因，其检测是转基因成分鉴定的关键环节。由于转基因产品涉及食品安全与监管合规，EPSPS基因检测需严格遵循标准化操作，以确保结果的准确性、重复性与可比性。本文围绕样品制备、核酸提取、PCR反应构建等关键步骤，详细梳理转基因成分鉴定中EPSPS基因检测的标准操作规范，为实验室实操提供明确指引。

样品制备的标准操作要求

样品的代表性直接影响检测结果可靠性，需根据类型选择抽样方法：种子样品按GB/T 3543.2随机抽取至少500g混合样；植株样品采集根、茎、叶等不同部位混合组织；加工产品（如大豆粉）按GB/T 29890用四分法缩分至100g以下。粉碎需用高速万能粉碎机，确保样品过40目筛，每处理一个样品后用75%乙醇擦拭内壁并晾干，避免交叉污染。样品需置于-20℃冰箱保存，期限不超过6个月，防止核酸降解。

基因组DNA提取的标准化流程

EPSPS基因检测需高质量基因组DNA，植物组织常用CTAB法：向研磨样品中加65℃预热的CTAB液（含2%CTAB、1.4mol/L NaCl、20mmol/L EDTA、100mmol/L Tris-HCl，pH8.0），孵育30分钟；加等体积氯仿-异戊醇（24:1），颠倒混匀10分钟，12000rpm离心10分钟取上清。加工产品用试剂盒法时，需严格按说明书控制离心力与时间，如磁珠法吸附步骤需室温放置5分钟，确保DNA充分结合。

提取后需用Nanodrop检测纯度（A260/A280为1.8~2.0）与浓度（≥50ng/μL）：纯度不足用酚-氯仿再抽提，浓度低用真空浓缩仪浓缩。同时用琼脂糖凝胶电泳验证完整性，完整DNA应呈现清晰高分子量条带，无拖尾。

PCR反应体系的优化与配置

引物需针对EPSPS基因保守区设计，常用序列：正向5’-ATGGCCTCTGCCGACGTTGC-3’，反向5’-TCAGATCTCGGTGACGGGCAG-3’（扩增150bp片段），需通过NCBI BLAST验证特异性。25μL体系标准配置：10×PCR Buffer（含Mg²⁺）2.5μL，dNTPs（2.5mmol/L each）2μL，上下游引物（10μmol/L）各0.5μL，Taq酶（5U/μL）0.2μL，模板DNA（50ng/μL）2μL，ddH₂O补足。

Mg²⁺浓度需优化：条带弱时从1.5mmol/L提至2.5mmol/L，非特异性条带多时降低至1.2mmol/L。配置时需冰上操作，避免酶失活；试剂混匀后短暂离心（1000rpm，1分钟）消除气泡。

PCR扩增与产物分析的操作规范

扩增程序按引物Tm值设定：预变性94℃5分钟；变性94℃30秒，退火58℃30秒，延伸72℃30秒，35循环；终延伸72℃10分钟。产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测（含0.5μg/mL SYBR Green I），120V电泳20分钟——SYBR Green I更安全，灵敏度与EB相当。

结果判定需结合对照：阳性对照（转基因大豆DNA）应有150bp条带，阴性对照（ddH₂O）无条带。待检样品出现对应条带后，需用Sanger测序验证，同源性≥99%方可判阳性。无条带时需重提DNA重试，仍无条带则检测抑制物：将模板与阳性对照混合PCR，若有条带说明含抑制物，需用Clean-Up试剂盒纯化DNA。

检测过程的质量控制与污染防控

实验室需分清洁区、提取区、扩增区、分析区，各区独立通风，设备专用：提取区用生物安全柜，扩增区用PCR超净台。试剂分装小剂量，避免反复冻融；每批试剂用阳性对照验证有效性。操作时戴一次性手套，每步更换；用带滤芯吸头，避免气溶胶污染。

每周环境监测：用棉签擦台面、设备，加50μL ddH₂O振荡，取2μL PCR检测。若阳性，用10%次氯酸钠擦所有表面，通风24小时后重测。

结果记录与报告的标准化要求

全程记录样品、试剂、仪器、操作参数与结果：记录用钢笔或加密电子文档，避免涂改——修改需划横线注日期与姓名。报告需含编号、委托方、样品信息、检测依据（如GB/T 19495.4）、方法、结果、签名与资质（CMA/CNAS）。可疑结果需注“需实时荧光PCR验证”，并说明原因（如条带弱）。报告一式两份，一份给委托方，一份存档5年。