保健食品抗氧化功效性验证的ORAC值测定方法

ORAC（氧自由基吸收能力）测定法是国际公认的保健食品抗氧化功效性验证核心方法之一，通过量化样品对氧自由基的清除能力，直观反映其抗氧化活性。该方法基于荧光素的氧化降解抑制原理，结果以Trolox（水溶性维生素E类似物）当量表示，因能模拟体内抗氧化过程、重复性好，被广泛用于维生素、多酚、花青素等保健食品功效成分的活性评价。本文将从概念、原理、操作细节到结果计算，全面解析ORAC值测定的标准化流程。

ORAC值的基本概念与类型

ORAC全称为Oxygen Radical Absorbance Capacity，是衡量样品抗氧化能力的定量指标，核心是“吸收”自由基的能力——即1单位样品能抑制多少自由基的氧化反应。与DPPH、FRAP等方法不同，ORAC法能模拟体内自由基的持续产生过程（如过氧自由基ROO·），更贴近生理环境下的抗氧化机制。

根据靶向自由基的不同，ORAC可分为总ORAC（涵盖水溶性和脂溶性抗氧化成分）、ORAC-ROO·（针对过氧自由基，最常用）、ORAC-OH·（针对羟基自由基）等。保健食品验证中，通常测定总ORAC或ORAC-ROO·，因过氧自由基是体内最常见的氧化损伤来源（如脂质过氧化）。

ORAC值的单位为μmol Trolox Equivalent（Trolox当量）/100g（固体样品）或μmol TE/mL（液体样品），Trolox作为基准物质，是因为其抗氧化活性稳定、水溶性好，能消除不同抗氧化成分的活性差异，使结果具有可比性。

ORAC测定的核心原理

ORAC法的关键是“荧光探针-自由基-抗氧化剂”的三元反应体系：荧光素（Fluorescein）作为荧光探针，在过氧自由基引发剂ABAP（2,2'-偶氮二(2-甲基丙脒)二盐酸盐）作用下，会逐步被氧化降解，荧光强度随时间呈指数衰减。

当体系中加入抗氧化剂（样品或Trolox）时，抗氧化剂会优先与过氧自由基结合，延缓荧光素的氧化，使荧光衰减曲线变平缓。通过计算“样品组荧光曲线下面积（AUC）”与“空白组（无抗氧化剂）AUC”的差值，再与Trolox的标准曲线对比，即可得到样品的ORAC值。

简单来说，ORAC值越大，说明样品能在更长时间内抑制荧光素的氧化，抗氧化能力越强。这种“时间-荧光强度”的动态监测，是ORAC法优于传统终点法（如DPPH仅测某一时间点的吸光度变化）的关键——它能反映抗氧化剂的“持续作用能力”，更符合体内自由基持续产生的实际情况。

样品前处理的标准化操作

样品前处理是ORAC测定的关键步骤，直接影响结果准确性，需根据样品形态（固体/液体）选择不同方法：

1、固体样品（如葡萄籽粉、枸杞干）：先将样品粉碎过80目筛，取0.5-1g粉末加入10mL提取溶剂（常用甲醇或70%乙醇，极性匹配多酚、花青素等成分），超声提取30分钟（功率200W，温度≤25℃），随后4℃、10000rpm离心15分钟，取上清液过0.22μm有机滤膜，备用。

2、液体样品（如果蔬汁、口服液）：直接取1mL样品，加入3mL甲醇（沉淀蛋白质，避免干扰荧光检测），涡旋混合1分钟，4℃离心10分钟，取上清液稀释至合适浓度（预实验确定，避免荧光淬灭）。

注意：提取过程需避光（防止光敏性成分如维生素A降解），提取溶剂需提前预冷（减少热敏性成分如维生素C的损失）；若样品含脂肪（如鱼油软胶囊），需先用正己烷脱脂，再用甲醇提取水溶性抗氧化成分，避免脂类干扰荧光信号。

试剂与仪器的选择要点

ORAC测定对试剂纯度和仪器精度要求极高，需严格筛选：

1、关键试剂：荧光素钠（HPLC级，纯度≥98%，需新鲜配制0.08μM工作液，避光保存）；ABAP（纯度≥99%，现配现用，150mM水溶液需在4℃保存不超过24小时）；Trolox标准品（纯度≥99%，储备液用甲醇配制为10mM，-20℃冷冻保存，工作液临用前稀释）。

2、仪器：荧光酶标仪（需支持动态荧光检测，激发波长485nm、发射波长528nm，温度控制在37℃±0.5℃）；高速冷冻离心机（4℃，最大转速≥10000rpm）；超声波清洗器（可调功率，带温度监控）。

提示：试剂需选择知名品牌（如Sigma-Aldrich、TCI），避免杂质干扰荧光信号；荧光酶标仪需每天用荧光素标准溶液校准，确保波长准确性——若激发波长偏移5nm，可能导致荧光强度误差超过20%。

标准曲线的制备与验证

标准曲线是将样品ORAC值转换为Trolox当量的核心依据，需严格遵循线性范围与平行性要求：

1、配制Trolox工作液：将10mM Trolox储备液用甲醇稀释为0、5、10、20、40μM的梯度浓度（覆盖常见样品的抗氧化范围）。

2、测定标准曲线：取20μL Trolox工作液加入96孔荧光板，再加180μL荧光素工作液，37℃预热10分钟，随后加入50μL ABAP溶液（150mM），立刻启动酶标仪，每2分钟记录一次荧光强度，持续120分钟。

3、计算AUC与线性回归：用酶标仪自带软件计算每个Trolox浓度的AUC（空白组AUC0，Trolox组AUCt），以“(AUCt - AUC0)”为纵坐标，Trolox浓度为横坐标，进行线性回归，得到标准曲线方程（如y=0.05x+0.12，r²≥0.99）。

注意：标准曲线需每天制备一次，确保Trolox的稳定性；平行样（同一浓度做3个复孔）的RSD需≤5%，否则需重新配制溶液——Trolox易吸潮，称量时需用干燥器保存。

样品测定的操作流程与细节

样品测定需与标准曲线同步进行，确保实验条件一致：

1、加样顺序：96孔板中先加20μL样品溶液（或甲醇空白），再加180μL荧光素工作液，37℃预热10分钟（使体系温度均匀）。

2、启动反应：快速加入50μL ABAP溶液（避免自由基提前产生），立即将板放入酶标仪，设置检测参数（激发485nm，发射528nm，间隔2分钟，总时间120分钟）。

3、记录与计算：酶标仪自动生成样品的荧光衰减曲线，计算样品AUCs，代入标准曲线方程，得到样品的ORAC值（如样品浓度为0.1g/mL，标准曲线计算得浓度为20μM，则ORAC值=20μM / 0.1g/mL × 100mL/100g = 2000μmol TE/100g）。

提示：样品需做3个复孔，取平均值；若样品AUCs超过标准曲线的线性范围（如>40μM Trolox对应的AUC），需稀释样品后重新测定——浓度过高会导致荧光淬灭（荧光强度突然下降），结果偏小。

关键影响因素的控制策略

ORAC测定的误差主要来自以下因素，需针对性控制：

1、荧光素稳定性：荧光素水溶液易受光照降解，需现配现用，配制后用铝箔包裹；若荧光素溶液放置超过4小时，需重新配制——降解的荧光素会导致空白AUC偏小，结果偏高。

2、ABAP浓度与反应温度：ABAP的浓度决定自由基产生速率（150mM是常用浓度），温度需严格控制在37℃（体内温度）——温度每升高1℃，自由基产生速率增加约10%，导致荧光衰减加快，ORAC值偏低。

3、样品基质干扰：蛋白质、多糖会淬灭荧光（如牛奶中的酪蛋白），需用甲醇沉淀去除；脂类会吸附荧光素（如鱼油），需用正己烷脱脂——基质干扰未去除会导致AUC偏小，结果不准确。

4、仪器稳定性：酶标仪的荧光检测器需定期校准（每3个月用标准荧光片检查）；96孔板需选择黑色或白色（黑色减少杂散光，白色增强荧光信号），避免透明板——透明板会导致相邻孔的荧光串扰，误差增大。

结果的计算与表达规范

ORAC值的计算需遵循以下公式：

ORAC值（μmol TE/100g或μmol TE/mL）= [(AUCs - AUC0) / (AUCT - AUC0)] × C_T × V / m × 100

其中：AUCs=样品AUC；AUC0=空白AUC；AUCT=Trolox标准品AUC；C_T=Trolox标准品浓度（μM）；V=样品提取液体积（mL）；m=样品质量（g，固体）或体积（mL，液体）。

结果表达需明确样品形态与单位，如“某葡萄籽粉的ORAC值为2500μmol TE/100g”“某蓝莓汁的ORAC值为50μmol TE/mL”。同时，需标注实验条件（如提取溶剂、反应时间），确保结果的可重复性——不同实验室若操作细节不同，同一样品的ORAC值可能相差10%-20%。

方法验证的关键指标与要求

为确保测定结果的可靠性，需对ORAC方法进行验证，核心指标包括：

1、准确性（回收率）：取已知ORAC值的样品（如市售维生素C片，ORAC值约1000μmol TE/100g），加入一定量的Trolox（如500μmol TE），测定回收率（回收率=（加标后ORAC值-原ORAC值）/加标量×100%），要求回收率在85%-115%之间。

2、精密度（重复性）：日内精密度是同一批样品同一天测6次，计算RSD≤10%；日间精密度是同一批样品连续测3天，计算RSD≤15%——精密度差说明操作或仪器不稳定，需排查原因。

3、线性范围：标准曲线的线性相关系数r²≥0.99，说明Trolox浓度与(AUCt - AUC0)呈良好线性关系——r²<0.99可能是因为Trolox浓度梯度设置不合理（如间隔太大）或荧光检测误差。

提示：方法验证需记录在实验报告中，作为保健食品功效验证的支撑资料——监管机构（如FDA、中国卫健委）要求ORAC测定需提供完整的方法学验证数据，否则结果不被认可。