食品微生物限度检测中菌落计数结果的不确定度评估方法

食品微生物限度检测是食品安全风险防控的核心技术手段之一，菌落计数结果作为判定食品卫生质量的直接依据，其准确性直接影响监管决策与消费者健康。然而，检测过程中样品制备、稀释、培养、计数等环节均存在误差，导致结果不可避免地存在不确定度。科学评估这些不确定度，既是实验室满足ISO/IEC 17025质量要求的必备内容，也是提升检测结果可靠性与可比性的关键。

不确定度的主要来源识别

食品微生物菌落计数的不确定度需从检测全流程逐一梳理。首先是样品制备环节：匀浆机转速不稳定或匀浆时间不足会导致样品颗粒分散不均，影响稀释的代表性；移液器的体积误差（如校准偏差、移液手法）会直接引入稀释倍数的不确定度。其次是接种与培养环节：培养基的凝固性、营养均匀性会影响菌落生长；培养箱温度波动（±1℃偏差）、培养时间不足或超时会改变菌落数量。再者是计数操作环节：操作人员对“可计数菌落”的判断差异（如边缘菌落、微小菌落识别）、菌落计数器分辨率误差，以及菌落重叠时的拆分准确性，均会引入主观与客观误差。最后是方法本身：微生物回收率（如样品基质包裹导致回收率低于100%）、方法重复性（同一人员多次检测的结果差异）与再现性（不同人员或实验室的差异），也是不可忽视的来源。

各来源的量化方法

每个不确定度来源需通过具体方法量化。样品稀释的不确定度：若用10mL移液枪（误差±0.05mL），单步稀释的相对标准不确定度为0.05/(10×√3)（矩形分布）；连续3次稀释则总相对不确定度为各步平方和开根号。重复性不确定度：同一人员对同一样品做6次平行检测，计算标准差（s），重复性标准不确定度为s/√n（n为平行样数）。回收率不确定度：向已知含量样品中加标准菌株，测回收率（R），计算回收率的标准差（s_R），相对标准不确定度为s_R/mean(R)。培养温度的不确定度：若培养箱波动±0.5℃，标准不确定度为0.5/√3，再结合温度对菌落生长的影响系数（如温度偏差0.5℃导致菌落数变化5%），将温度误差转化为计数不确定度。

不确定度分量的合并与扩展

分量量化后，需按“平方和开根号”合成标准不确定度（u_c）。先将各分量转为相对标准不确定度（若为绝对量，除以结果平均值），再计算合成相对标准不确定度（u_cr）=√(u1²+u2²+…+un²)，乘以结果平均值（x）得合成标准不确定度（u_c=u_cr×x）。例如，某样品结果100CFU/g，各相对分量：稀释0.02、重复性0.03、回收率0.01、培养0.01，合成相对不确定度≈√(0.02²+0.03²+0.01²+0.01²)=0.0387，合成标准不确定度≈3.87CFU/g。扩展不确定度（U）是合成标准不确定度乘以包含因子（k，通常取2，对应95%置信概率），即U=2×3.87≈7.74CFU/g，最终结果表示为(100±8)CFU/g（k=2）。

实例应用：以饼干菌落总数检测为例

以饼干检测为例，流程如下：样品制备——25g饼干加225mL生理盐水，匀浆1min（转速3000rpm）。制备的不确定度：25g称量误差±0.1g（相对0.0023）、225mL体积误差±1mL（相对0.0025）、匀浆均匀度（相对0.01），合成相对不确定度≈√(0.0023²+0.0025²+0.01²)=0.0105。稀释环节：1mL移液枪（误差±0.01mL）做1:100稀释，相对不确定度≈√(0.0058²+0.0058²)=0.0082。培养环节：36℃培养48h（波动±0.5℃），相对不确定度≈0.0080。计数环节：2人计数标准差2CFU，相对不确定度2/100=0.02。

合成相对不确定度≈√(0.0105²+0.0082²+0.0080²+0.02²)=0.0253，合成标准不确定度100×0.0253≈2.53CFU/g，扩展不确定度（k=2）≈5.06CFU/g，结果报告为(100±5)CFU/g（k=2）。

评估过程中的关键注意事项

避免评估偏差需注意：一是全面识别来源，勿忽略“回收率”或“人员计数主观性”；二是规范数据收集，重复性实验至少做6次，用有效校准证书；三是考虑分量相关性，如移液枪导致的稀释与接种误差，需加2×r×u1×u2（r为相关系数）；四是避免分布假设错误，如重复性应按正态分布而非矩形分布。此外，实验室需定期培训人员（如计数一致性练习）、验证方法（如回收率实验）、校准设备（如移液枪、培养箱），确保误差可控，为评估提供可靠数据。