护手霜类日化产品检测中抗氧化性能评价的DPPH法实验

护手霜的抗氧化性能是衡量其延缓肌肤氧化损伤、维持屏障功能的核心指标，直接影响产品对干燥、细纹等问题的改善效果。DPPH法作为快速灵敏的自由基清除评价方法，因操作简便、重复性好，被广泛用于护手霜类产品的抗氧化检测。本文从实验原理、样品处理、操作步骤及误差控制等方面，详细解析DPPH法在护手霜检测中的应用要点，为企业质量控制提供实用参考。

DPPH法用于护手霜抗氧化检测的原理

DPPH（1,1-二苯基-2-三硝基苯肼）是稳定有机自由基，乙醇溶液呈深紫色，在517nm处有最大吸收峰。当护手霜中的抗氧化成分（维生素E、茶多酚、迷迭香提取物等）与DPPH接触时，抗氧化物质的孤对电子会结合DPPH的未成对电子，使DPPH转变为稳定非自由基分子，溶液褪色、吸光度下降。

吸光度下降程度与抗氧化成分的含量及活性正相关——吸光度越低，清除DPPH能力越强，抗氧化性能越好。相比FRAP、ABTS等方法，DPPH法无需酶促体系，更适合护手霜这类小分子抗氧化剂为主的产品，能快速反映实际功效。

实验前的样品处理与试剂仪器准备

护手霜是膏体，需先提取有效成分：称取1.0g样品（精确至0.001g）置于50mL离心管，加20mL无水乙醇，用200W、30℃超声提取30分钟；4000rpm离心10分钟，取上清液过0.45μm有机滤膜，得待测液（24小时内使用）。

试剂需提前配制：①0.1mmol/L DPPH乙醇溶液：称0.0039g DPPH（≥98%），用乙醇定容至100mL，棕色瓶4℃冷藏（现配现用）；②阳性对照：0.1mg/mL维生素C乙醇溶液（验证体系有效性）。

仪器包括：紫外分光光度计（校准至517nm）、数控超声清洗器（控温≤30℃）、高速离心机（0-10000rpm）、精密移液枪（1mL/5mL）、棕色容量瓶及比色皿（避免光解）。

DPPH法的具体实验操作步骤

第一步，配梯度样品液：用乙醇将待测液稀释为0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0g/mL的系列浓度（覆盖实际使用量，体现浓度依赖性）。

第二步，建反应体系：取10mL比色管，按比例加试剂：①空白组（2mL DPPH+1mL乙醇）；②样品组（2mL DPPH+1mL梯度样品液）；③样品空白组（2mL乙醇+1mL梯度样品液，扣样品颜色干扰）；④阳性对照组（2mL DPPH+1mL维生素C液）。每组设3个平行样。

第三步，孵育反应：用铝箔包裹比色管，25℃恒温静置30分钟（避光，确保反应完全）。时间过短反应不完全，过长则DPPH降解，影响结果。

第四步，测吸光度：以乙醇为参比，517nm波长下测各组吸光度（记为A0空白、As样品、As0样品空白、Ac阳性对照）。测前用空白组校准零点，比色皿需擦净指纹。

实验结果的计算与有效性判断

核心指标是自由基清除率，公式：清除率（%）= [1 - (As - As0)/A0] × 100%。其中As0扣除样品本身颜色干扰，A0反映DPPH初始浓度。

先验证体系有效性：维生素C组清除率应≥80%（0.1mg/mL时），若低于则DPPH已降解，需重配试剂。对护手霜，需绘“浓度-清除率”曲线——若线性良好（R²≥0.95），说明结果可靠；若出现平台期，最高清除率即为最大抗氧化能力。

比如含茶多酚的护手霜0.8g/mL时清除率75%，含维生素E的同浓度下55%，符合茶多酚活性更高的结论，结果合理。

实验中的关键注意事项与误差控制

1、DPPH稳定性：现配现用，未用的4℃冷藏不超24小时。若溶液变浅粉，说明降解，弃用。

2、样品提取：超声温度≤30℃（防成分破坏），时间≥30分钟（确保溶出）。含大量油脂时，延长离心至15分钟或提转速至5000rpm，避免油脂干扰。

3、吸光度准确性：光度计预热30分钟，波长偏差≤±2nm；比色皿无划痕，测后用乙醇冲洗，防交叉污染。

4、平行样一致性：平行样RSD需≤5%。比如3个平行样吸光度0.521、0.518、0.525，RSD=0.6%，符合要求；若RSD>5%，需重测。

护手霜成分对结果的影响与排除

1、表面活性剂（如吐温80）：含量高会产泡沫，增加离心次数（3次）去除。

2、色素（如柠檬黄）：需测样品空白组，扣除颜色干扰。比如某护手霜样品空白吸光度0.12，未扣的话清除率虚高10%。

3、防腐剂（如尼泊金酯）：有弱抗氧化性，需用无防腐剂的基础膏体做空白，扣除其影响。

结果的重复性与可比性保障

需统一实验条件：参照QB/T 4963-2016标准，超声时间、离心转速、孵育时间等参数一致；用同一品牌批次的试剂（如DPPH、乙醇）；用Excel计算平均值和标准差，避免人工错误；报告需注明样品浓度、清除率、RSD、阳性对照结果，便于对比。

比如某企业连续3次测同一批次护手霜，清除率72%、73%、71%，RSD=1.4%，重复性好；若另一实验室用20分钟超声，结果65%，需核对条件后重测。