日化产品检测中微生物致病菌（绿脓杆菌）的检测及鉴定流程

日化产品如化妆品、洗涤剂、湿巾等直接接触人体皮肤或黏膜，一旦被微生物污染可能引发感染，其中绿脓杆菌（铜绿假单胞菌）是常见致病菌之一。该菌能产生绿脓菌素、外毒素A等物质，可导致皮肤化脓、角膜炎甚至败血症，尤其对婴幼儿、免疫力低下人群风险更高。因此，严格检测日化产品中的绿脓杆菌是保障消费者安全的关键，需遵循严谨的流程确保结果准确。

一、样品的采集与前处理：避免污染是基础

样品采集需全程无菌操作：使用经121℃高压灭菌20分钟的工具（如无菌勺、吸管、均质袋），采样时避免手或空气接触样品。液体产品（如化妆水、洗手液）摇匀后，用无菌吸管取10ml注入含90ml无菌稀释液（0.85%生理盐水）的三角瓶，制成1:10匀液；固体/半固体产品（如面霜、皂块）称取10g，加入90ml稀释液，用无菌均质器以8000r/min均质1分钟，确保样品充分分散。

稀释度需适配产品特性：清洁类产品（如洗洁精）污染少，可直接用1:10稀释；保湿乳液、面膜等营养丰富的产品，需制备1:100、1:1000稀释液，防止平板菌落过密无法计数。处理后的样品需2小时内培养，若延迟需4℃冷藏，但不超过24小时——低温会抑制微生物繁殖，避免结果偏差。

二、增菌培养：打破防腐剂的抑制

日化产品中的防腐剂（如尼泊金酯、苯扎氯铵）会“杀死”或抑制微生物，因此需先用增菌液复苏目标菌。常用SCDLP肉汤（大豆酪蛋白消化肉汤+卵磷脂+吐温80）：卵磷脂中和季铵盐，吐温80溶解脂质，为细菌提供“逃生通道”。

取10ml样品匀液接种90ml SCDLP肉汤，36±1℃培养18-24小时。若肉汤变浑浊，说明有菌生长；若澄清，可延长至48小时，但需注意：过长培养会让杂菌快速繁殖，反而抑制绿脓杆菌——增菌的核心是“唤醒”目标菌，而非让所有菌泛滥。

三、分离培养：用选择性培养基“抓”目标菌

增菌后需用选择性培养基筛选绿脓杆菌，最常用的是cetrimide琼脂（十六烷基三甲基溴化铵琼脂）。这种培养基中的阳离子表面活性剂能抑制革兰氏阳性菌和大部分革兰氏阴性菌，只有绿脓杆菌等少数菌能存活。

用接种环取增菌液，在cetrimide平板上划“Z”字线（避免菌落重叠），36℃培养24-48小时。典型绿脓杆菌菌落是“蓝绿色+金属光泽+大而扁平”——绿脓菌素会扩散到培养基中，让菌落周围变成蓝绿色；部分菌株会产荧光素，紫外线照射下呈黄绿色，这些特征是“可疑信号”。

四、初步鉴定：形态与基础生化的“初筛”

第一步是革兰氏染色：挑可疑菌落涂片，经结晶紫、碘液、乙醇、番红处理后，镜下是“革兰氏阴性短杆菌，两端钝圆”——绿脓杆菌的形态特征很典型，能排除革兰氏阳性菌（如金黄色葡萄球菌）。

第二步是氧化酶试验：用玻璃棒蘸菌落涂在氧化酶试纸上，10秒内变蓝紫色为阳性——绿脓杆菌有细胞色素氧化酶，能快速催化反应，这一步能筛掉90%的非目标菌（如不动杆菌氧化酶阴性）。

第三步是OF试验：接种Hugh-Leifson培养基，一支加液体石蜡（厌氧），一支不加（有氧）。绿脓杆菌是“氧化型”：只有有氧试管会变黄（分解葡萄糖产酸），厌氧试管不变色——这能区分发酵型细菌（如大肠杆菌，厌氧也产酸）。

五、确认鉴定：绿脓菌素的“终极验证”

绿脓菌素是绿脓杆菌的“身份证”——90%以上的菌株会产这种蓝绿色色素，且是唯一能产生的细菌。试验方法是：挑菌落接种PDP琼脂（绿脓菌素产生培养基），36℃培养48小时，加氯仿振荡提取，再加盐酸——若上层出现粉红色，说明产绿脓菌素，直接确认是绿脓杆菌！

若绿脓菌素阴性（约10%的菌株不产），需做荧光素试验：接种King A培养基，36℃培养24小时，紫外线照射下有黄绿色荧光，结合氧化酶阳性、OF氧化型，也能确认；此外，硝酸盐还原试验（能把硝酸盐变亚硝酸盐，加试剂变红）、明胶液化试验（产明胶酶，培养基变液体）也是辅助证据。

六、分子生物学：解决“疑难杂症”

若菌落形态或生化反应不典型（如不产绿脓菌素但其他符合），需用PCR“查基因”。常用toxA基因（编码外毒素A，绿脓杆菌特有）或16S rRNA基因（物种特异性序列）。

操作很简单：取菌落做菌悬液，提取DNA，用特异性引物PCR扩增，电泳后若出现预期条带（如toxA基因350bp），直接确认。分子方法的优势是“快且准”——比如批量检测时，能避免生化试验的繁琐，也不会漏检“特殊菌株”。

七、结果判断与报告：用数据说话

结果判定要“综合所有证据”：若菌落典型、革兰氏阴性、氧化酶阳性、绿脓菌素阳性，直接判“检出绿脓杆菌”；若绿脓菌素阴性，但荧光素+OF氧化型+分子阳性，也判检出；若所有试验都阴性，判“未检出”。

报告需写清楚：产品名称、批号、采样日期、检测方法（如GB 7918-1987《化妆品微生物标准检验方法》）、结果（如“检出铜绿假单胞菌，菌落数1.5×10²CFU/ml”）。注意：不能只写“检出绿脓杆菌”，要附菌落数——这是评估污染程度的关键，也是企业整改的依据。