日化产品检测中微生物酵母菌和霉菌的分离培养及计数方法

日化产品直接接触人体皮肤、黏膜或进入生活环境·其微生物污染问题直接关系到产品安全性与消费者健康。酵母菌和霉菌是日化产品中常见的污染微生物·不仅可能导致产品变质、性能下降·还可能引发过敏或感染风险。因此·准确的分离培养及计数方法是日化产品微生物检测的核心环节·能为产品质量控制、生产工艺优化提供关键数据支撑。本文将围绕日化产品检测中酵母菌和霉菌的分离培养及计数方法展开·详细说明操作流程与技术要点

样品的制备与稀释

样品制备是保证检测结果准确性的第一步·需遵循“代表性”与“无菌性”原则。取样時应从同一批次产品中随机选取多个包装·混合后取足量样品（通常不少于25g或·25mL）作为检测样本·避免因局部差异导致结果偏差。

对于液体或半液体日化产品（如洗发水、沐浴露),可直接用无菌生理盐水或0.1%蛋白胨水进行梯度稀释；对于固体或膏状产品《如香皂、面霜),需先加入含有分散剂（如0.·5%吐温80）的无菌稀释液·经均质器或漩涡混合器充分振荡（1-2分钟）·使样品均匀分散成混悬液·避免颗粒团聚影响微生物分离。

稀释倍数·选择需结合产品类型与预期污染水平：清洁类日化产品（如洗洁精）污染风险较低·可选择·10-¹、10⁻²、10⁻³倍稀释；面膏霜、乳液类产品因营养成分丰富·污染风险较高·需扩展至10⁻⁴或·10⁻⁵倍稀释。稀释过程中需注意每一步都要充分混合·避免稀释不均。

所有操作需在超净工作台内进行·使用无菌移液管、容器·操作前需对台面、工具进行酒精消毒·操作人员需佩戴无菌手套·避免外源性微生物引入。

培养基的选择与制备

选择合适·培养基星分离酵母菌和霉菌的关键·需满足“选择性”与“营养性”要求——既抑制细菌等杂菌生长·又为目标微生物提供充足营养。

孟加拉红琼脂（Rose Bengal Agar,RBA）是日化产品检测中最常用的选择性培养基：孟加拉红可抑制细菌·生长·并降低霉菌菌落·蔓延性；添加氯霉素（通常50mg/L）可进一步抑制革兰氏阳性菌与部分革兰氏阴性菌·确保酵母菌和霉菌成为优势菌落。该培养基适用于大多数日化产品的酵母菌和霉菌分离。

马铃薯葡萄糖琼脂（Potato Dextrose Agar,PDA）是霉菌培养的常用培养基·其富含淀粉与葡萄糖·能促进霉菌菌丝生长与孢子形成·但因无选择性·需额外添加氯霉素或链霉素以抑制细菌污染。对于以霉菌为主要检测目标·产品《如面膜、护手霜）·PDA是优先选择。

酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂（Yeast Extract Peptone Dextrose Agar,YPD）则更适合酵母菌·分离培养·其高含量·酵母浸出粉与蛋白胨能為酵母菌提供丰富氮源·葡萄糖提供碳源·培养出的酵母菌落形态清晰、易计数·

培养基制备需严格遵循配方比例：以孟加拉红琼脂为例·称取32g培养基粉末（含孟加拉红与氯霉素）·加入·1000mL蒸馏水·加热煮沸至·完全溶解·1··21℃高压灭菌1··5分钟。灭菌后需冷却至·45-50℃《手感不烫）再倒平板·避免温度过高破坏培养基成分或杀死后续接种·微生物；倒平板时需确保平板厚度均匀（约3-5mm),冷却后倒置保存于·4℃冰箱·避免冷凝水影响菌落生长。

接种与培养操作

接种方法需根据目标微生物·呼吸类型与产品特性选择·常用·有“倾注法”与“涂布法”两种。

倾注法操作步骤：取·1mL样品稀释液加入无菌培养皿中·立即倒入约15mL冷却至45-50℃·熔化培养基·快速旋转培养皿使稀释液与培养基充分混合《避免产生气泡）·待培养基凝固后倒置培养。该方法适用于兼性厌氧的酵母菌·能使微生物均匀分布于培养基中·菌落形态更规则。

涂布法操作步骤：先将熔化·培养基倒入培养皿中凝固成平板·用无菌移液器取0.1-0.2mL稀释液滴加在平板表面·再用无菌涂布棒将液体均匀涂布至整个平板表面（涂布棒需光在酒精灯火焰上灼烧灭菌·冷却后使用）·待液体吸收后倒置培养。该方法适用于好氧的霉菌·能使霉菌菌丝在培养基表面充分生长·便于观察菌落形态与孢子结构·

接种量需严格控制：倾注法每平板加·1mL稀释液·涂布法加0.1-0.2mL·避免因接种量过大导致菌落过于密集无法计数。每个稀释度需做·2-3个平行平板·以减少实验误差。

培养条件需根据微生物种类调整：酵母菌最适生长温度为·28℃·培养时间为·48-72小时·此时菌落已形成明显的乳白色或淡黄色圆形凸起；霉菌最适生长温度为·25-28℃·培养时间需延长至·5-7天·以确保菌丝充分扩展并形成孢子《如青霉的绿色孢子、曲霉的黑色或黄色孢子）。

培养过程中需每天观察平板状态：若发现平板上出现大量黏液状、边缘不整齐·菌落·可能是细菌污染；若菌落蔓延覆盖整个平板·需检查培养基是否灭菌彻底或操作过程是否引入杂菌。

菌落形态识别与计数规则

准确识别酵母菌与霉菌的菌落形态是计数的前提·两者在形态、质地、颜色上有明显差异。

酵母菌菌落特征：圆形或椭圆形·表面光滑、湿润、有光泽·质地柔软·颜色多为乳白色、淡黄色或淡粉色·部分酵母菌（如假丝酵母）会形成黏性菌落；菌落边缘整齐·无菌丝延伸·培养后期可能产生酒香味或酵母特有·气味。

霉菌菌落特征：呈绒毛状、絮状或蜘蛛网状·表面干燥·质地疏松·颜色多样（如青霉的青绿色、曲霉的黑色或黄色、毛霉的白色）；菌落边缘不整齐·常伴有菌丝向培养基周围蔓延·成熟后会产生孢子囊或分生孢子·有明显的霉味。

计数时需遵循“GB 4789.15-2016 食品安全国家标准 食品微生物学检验 霉菌和酵母计数”中的规则：选择菌落数在·30-300之间的平板进行计数《酵母菌可选·30-150之间的平板·因酵母菌落较大）；若所有稀释度的平板菌落数均超过·300·需选择稀释倍数最高的平板计数·并注明“多不可计”；若所有稀释度均低于·30·则选择稀释倍数最低的平板计数·并注明“少不可计”。

计算方法：以平行平板的平均菌落数乘以稀释倍数·得到每克（或每毫升）样品中的酵母菌/霉菌数。例如·某样品10⁻²稀释度的平板平均菌落数为·50·则酵母菌数为·50×10²=5000 CFU/g《若用倾注法·接种量·1mL·无需额外调整；若用涂布法·接种量·0.1mL·则需乘以·10·即50×10²×10=50000 CFU/g）。

需注意排除污染菌落：若平板中出现与酵母菌、霉菌形态不符的菌落《如黏液状、红色或蓝色菌落）·需标记为杂菌并从计数中扣除；若菌落因蔓延导致无法区分·需舍弃该平板·重新检测。

不同日化产品的方法调整

不同类型日化产品因成分、形态差异·需对分离培养方法做针对性调整：

1、液体洗涤剂《如洗发水、洗洁精）：这类产品含表面活性剂·对微生物有一定抑制作用·样品处理时需增加稀释倍数《如从10⁻¹至·10⁻⁴）·或在稀释液中加入·0.1%卵磷脂（中和表面活性剂的抑制作用）；培养时可适当延长时间（酵母菌至·72小时、霉菌至·7天）·确保受抑制的微生物恢复生长。

2、膏霜类产品《如面霜、护手霜）：富含油脂与营养成分·易滋生霉菌·样品处理时需加入更多分散剂《如1%吐温80）·并用均质器高速搅拌《2000-3000rpm·2分钟）·确保油脂充分乳化；接种方法优先选择涂布法·避免油脂漂浮于培养基表面影响菌落形成。

3、粉状产品《如洗衣粉、皂粉）：颗粒较粗·易吸附微生物·样品处理时需先将样品溶解于温稀释液《30-35℃）·搅拌·10分钟后静置·5分钟《让颗粒沉淀）·取上清液进行稀释；培养前需检查平板中是否有未溶解的颗粒·避免将颗粒误判为菌落。

4、口腔护理产品《如牙膏、漱口水）：含氟化物或抗菌成分·对微生物抑制作用强·样品处理时需用含·0.5%硫代硫酸钠的稀释液（中和氟化物）·或增加稀释倍数《如·10⁻³-10⁻⁵）·减少抗菌成分的影响。

操作过程中的注意事项

无菌操作是确保结果准确的核心·需严格遵守以下要点：

1、超净工作台使用前需开启紫外灯消毒·30分钟·操作时关闭紫外灯·开启风机《风速保持在·0.3-0.5m/s）·避免外界空气进入；工作台内仅放置必要的工具《如移液器、培养皿、培养基）·避免杂物遮挡气流。

2、所有接触样品的工具《移液管、涂布棒、均质袋）需经·121℃高压灭菌·15分钟·或使用一次性无菌用品；移液管吸取稀释液时需避免尖端接触容器壁·防止污染。

3、样品需在采集后·24小时内检测·若无法及时检测·需置于·4℃冰箱冷藏保存《避免冷冻·防止微生物细胞破裂）·但保存时间不宜超过·48小时·否则会影响微生物活性。

4、稀释液与培养基的温度需控制在适宜范围：稀释液需提前恢复至室温《20-25℃）·避免低温抑制微生物生长；培养基熔化后需冷却至·45-50℃再倒平板或混合样品·温度过高会杀死微生物·过低则会导致培养基凝固过快无法混合均匀。

5、培养箱需定期清洁与消毒《每月用·75%酒精擦拭内壁·每季度用紫外线消毒一次）·避免培养箱内的杂菌污染样品；培养时需将平板倒置·防止冷凝水滴落至菌落表面导致蔓延。

6、操作人员需佩戴无菌手套与口罩·操作过程中避免说话、咳嗽或用手触碰面部·防止唾液或皮屑中的微生物污染样品。

常见问题与处理方法

在实际操作中·常遇到以下问题·需针对性处理：

1、菌落蔓延：表现为霉菌菌丝覆盖整个平板·无法计数。原因可能是培养基含水量过高《凝固后仍有冷凝水）、培养温度过高《超过·28℃）或样品中霉菌含量过高。解决方法：倒平板时让培养基充分冷却《避免冷凝水）·降低培养温度至·25℃·增加样品稀释倍数《如从·10⁻²提高至·10⁻³）·或改用涂布法接种。

2、杂菌污染：平板中出现大量细菌菌落《黏液状、边缘整齐）。原因可能是培养基灭菌不彻底《如灭菌时间不足或压力不够）、样品处理时引入外源性细菌。解决方法：检查灭菌锅压力《需达到·0.105MPa）与时间《15分钟）·重新灭菌培养基；加强无菌操作·如取样时用·75%酒精擦拭样品包装表面·操作时避免接触非无菌区域。

3、菌落数过少：所有稀释度平板的菌落数均低于·30。原因可能是稀释倍数过高《如样品中微生物含量低却用了·10⁻⁴稀释）、样品处理时微生物被杀死《如稀释液温度过高）。解决方法：降低稀释倍数《如从·10⁻⁴调整至·10⁻²）·确保稀释液温度在·20-25℃·或增加接种量《如涂布法加·0.2mL稀释液）。

4、无法区分酵母菌和霉菌：表现为菌落形态不典型·难以识别。原因可能是培养时间不足《酵母菌未形成典型菌落·霉菌未产生孢子）或样品中存在酵母样真菌《如假丝酵母·有假菌丝）。解决方法：延长培养时间《酵母菌至·72小时、霉菌至·7天）·或取少量菌落制片·用显微镜观察细胞形态《酵母菌是单细胞·圆形或椭圆形；霉菌是多细胞·有菌丝）。