土壤检测中微生物群落多样性的检测方法

土壤微生物群落多样性是土壤生态系统功能的核心驱动因素，参与有机质分解、养分循环及植物病虫害调控等关键过程。准确检测其多样性，对理解土壤健康、农业可持续发展及生态修复具有重要意义。本文系统梳理土壤检测中常用的微生物群落多样性方法，解析各方法的原理、操作要点与适用场景。

传统培养法：基于可培养性的基础检测

传统培养法是最经典的微生物多样性检测方法，核心原理是利用不同微生物对营养物质、温度、pH等条件的偏好，将土壤样品中的微生物分离并培养成可见菌落，通过菌落形态、生理生化特征或分子鉴定确定物种类型及数量。操作流程包括土壤样品梯度稀释（10倍系列稀释至10⁻⁶～10⁻⁸）、涂布于选择性/非选择性培养基（如牛肉膏蛋白胨培养基）、28℃～37℃恒温培养2～7天，最后计数菌落形成单位（CFU）并鉴定物种。

该方法的优势在于操作简单、成本低廉，且能获得可培养的纯菌株，便于后续功能研究（如筛选产酶菌株、生防菌）。但局限性明显——土壤中仅约0.1%～10%的微生物可在人工培养基上生长，大量不可培养的“隐性”微生物类群被遗漏，无法反映群落的真实多样性，因此更适用于针对性分离特定功能菌（如固氮菌、解磷菌），而非全面解析群落多样性。

Biolog微平板法：功能多样性的快速分析

Biolog微平板法以微生物的碳源代谢特征为核心，利用不同微生物对碳源的代谢能力差异，通过显色反应检测功能多样性。该方法将31种单一碳源（如糖类、氨基酸、脂肪酸）加入微平板，同时添加四唑类显色剂（如MTT），微生物代谢碳源时会还原显色剂，使孔液变色。操作时需提取土壤微生物悬浮液，调整浓度后接种至Ecoplates（适用于环境微生物），培养后检测590nm吸光度，分析平均颜色变化率（AWCD）等指标。

该法的优点是快速、直观，能反映微生物的代谢活性与碳源利用偏好（如施肥处理后对碳水化合物的代谢增强），但无法区分活微生物与死微生物的代谢差异，且结果受培养温度、接种浓度等条件影响较大，仅能反映功能层面的多样性。适用于比较不同土壤环境（如污染与清洁土壤、有机与常规农业土壤）的功能差异，或评估土壤生态功能的恢复状况。

PLFA分析法：生物标志物的群落结构解析

磷脂脂肪酸（PLFA）是微生物细胞膜的重要组成成分，不同微生物类群（如细菌、真菌、放线菌）会合成特异性PLFA（如细菌的16:0、真菌的18:2ω6,9、放线菌的10Me-16:0）。PLFA分析法通过提取土壤中的PLFA，水解为脂肪酸甲酯（FAME），再用气相色谱（GC）或气相色谱-质谱联用（GC-MS）分析FAME的种类及浓度，从而解析微生物群落的结构组成。

该方法的优势在于无需培养微生物，能快速反映活微生物的群落结构（因PLFA在微生物死亡后会迅速降解），且可定量分析不同类群的相对丰度（如真菌/细菌比（F/B）反映群落平衡）。但部分PLFA标志物的特异性有限（如16:1ω7c既存在于细菌也存在于藻类），无法区分近缘物种，适用于分析土壤微生物群落的结构变化（如重金属污染、耕作方式改变后的类群演替）。

16S rRNA基因测序：高通量系统发育检测

16S rRNA基因是细菌和古菌核糖体小亚基的编码基因，具有“保守区+可变区”的结构特征——保守区序列高度相似，便于设计通用引物；可变区（V1-V9）序列因物种而异，具有种属特异性。16S测序通过PCR扩增可变区（如V3-V4区，引物341F/806R）、高通量测序（Illumina MiSeq），结合生物信息学软件（如QIIME2）进行质控、聚类（OTU/ASV）及物种注释（参考SILVA数据库），揭示微生物群落的物种组成及系统发育关系。

该方法是当前土壤微生物群落多样性检测的“金标准”，优势在于高通量、高分辨率——可同时检测土壤中几乎所有微生物类群（包括可培养与不可培养类群），鉴定到属甚至种水平（如ASV分析可区分不同菌株），且能定量分析物种的相对丰度（如某土壤中变形菌门占比40%、酸杆菌门占比20%）。但依赖土壤DNA的提取质量（腐殖质、重金属会抑制DNA提取），且PCR扩增存在引物偏好性（可能低估稀有类群），适用于土壤微生物组研究、连作障碍菌群分析等场景。

宏基因组测序：物种与功能的深度整合

宏基因组测序（Metagenomics）直接对土壤样品中的总DNA进行高通量测序，无需PCR扩增，能获得所有微生物（细菌、真菌、古菌、病毒）的基因组片段，从而同时解析群落的物种组成及功能基因多样性。操作流程包括提取高质量土壤总DNA、构建测序文库（如Illumina短片段文库）、高通量测序（Illumina HiSeq），再通过生物信息学分析（如MetaPhlAn注释物种、KEGG注释功能基因）获得物种组成（如真菌占比10%、细菌占比85%）及功能基因分布（如纤维素分解基因celA占比5%）。

该方法的核心优势是“一站式”解析——既可以获得物种多样性信息，又能揭示微生物的功能能力（如分解纤维素、固氮的基因潜力），并关联物种与功能（如假单胞菌属丰度高时，其携带的解磷基因phoD丰度也高）。但成本较高、数据量大且分析复杂，适用于深入研究土壤微生物的“物种-功能”关联（如土壤碳循环功能基因的分布）。

DGGE/TGGE：群落差异的指纹分析

变性梯度凝胶电泳（DGGE）和温度梯度凝胶电泳（TGGE）是基于DNA变性特性的分子指纹技术，原理是不同序列的DNA片段具有不同的解链温度（Tm值），在含有变性剂梯度（尿素+甲酰胺，DGGE）或温度梯度（TGGE）的凝胶中电泳时，DNA片段会在与其Tm值匹配的位置停止迁移，形成不同条带，每条条带代表一种或一组亲缘关系较近的微生物。操作包括提取土壤DNA、GC夹修饰PCR扩增（如16S V3区）、电泳、染色（EB/SYBR Green），观察条带图谱。

该方法快速、成本低，能直观反映不同土壤样品的群落差异（如污染土壤的条带数量比清洁土壤少，说明多样性下降），还可通过切胶测序鉴定优势物种（如回收亮条带测序后发现是芽孢杆菌属）。但分辨率低，仅能检测群落中的优势类群（丰度≥1%），无法定量，适用于快速筛选群落差异样品（如污染与清洁土壤、不同施肥处理土壤）。

ITS rRNA基因测序：真菌群落的特异性检测

真菌是土壤微生物群落的重要组成部分，但16S rRNA基因主要针对细菌和古菌，因此真菌多样性检测需使用ITS（内部转录间隔区）rRNA基因——ITS位于18S与28S rRNA基因之间，变异性高，是真菌物种鉴定的关键分子标记。操作流程与16S测序类似：提取土壤总DNA、PCR扩增ITS区（如ITS1F/ITS2R靶向ITS1区）、高通量测序（Illumina MiSeq）、生物信息学分析（参考UNITE数据库注释）。

该方法针对性强，能高效检测土壤中的真菌类群（包括酵母菌、霉菌、大型真菌），分辨率高（可鉴定到种水平，如区分尖孢镰刀菌的不同生理小种），还能检测真菌的功能类群（如菌根真菌Glomus属、病原真菌Fusarium属）。但存在与16S测序类似的局限性（依赖DNA质量、PCR偏好性），适用于真菌群落研究（如菌根真菌与植物共生关系、病原真菌监测）。