生物相容性检测中刺激性测试的样品制备要求

生物相容性检测是评估医疗产品、化妆品及生物材料安全性的核心环节，其中刺激性测试（包括皮肤、眼及黏膜刺激）直接反映材料与机体接触后的即时反应。而样品制备作为测试的第一步，其规范性直接影响结果的准确性与可靠性——若样品处理不当（如成分流失、均一性差、污染），即使后续测试流程标准，也可能得出错误结论。本文聚焦刺激性测试中不同类型样品的制备要求，从提取物参数、固体/液体/半固体样品处理到对照品规范，系统解析关键环节的操作细节。

刺激性测试样品的类型与前处理原则

刺激性测试的样品涵盖固体（如金属植入物、聚合物敷料）、液体（如注射液、化妆水）、半固体（如软膏、凝胶）三大类，前处理的核心原则是“保持样品固有性质，消除物理干扰”。对于固体样品，需根据测试部位调整形态：皮肤刺激测试需将块状材料切割为面积≤1cm²、厚度≤2mm的平整样品，避免尖锐边缘划伤皮肤；眼刺激测试的固体则需研磨成细粉（粒径≤10μm），模拟实际使用中的颗粒接触。

液体样品需先检查均一性：若有沉淀，需通过低速离心（≤3000rpm，5分钟）去除不溶性杂质，但需记录离心条件——若沉淀为样品有效成分，则不能去除，需说明情况。半固体样品如膏霜，需用高速均质机（10000rpm，5分钟）均质至无肉眼可见颗粒，确保涂抹时不会因颗粒摩擦导致假阳性刺激。

需注意的是，所有前处理操作均不能改变样品的化学组成：例如聚合物材料不能用强溶剂清洗，避免溶出添加剂；热敏性样品（如含蛋白的凝胶）不能加热均质，需在4℃下进行。

提取物制备的核心参数控制

刺激性测试中，多数样品需制备提取物（浸提液）以模拟材料在体内的溶出行为。提取介质的选择需匹配测试模型：皮肤刺激用生理盐水（模拟组织液）或芝麻籽油（模拟脂溶性环境）；眼刺激用等渗氯化钠溶液（模拟泪液）；黏膜刺激用人工唾液（pH 6.8）。

提取比例是关键参数，通常遵循ISO 10993-12标准的1:10（w/v，固体样品质量g：介质体积mL）或1:2（v/v，液体样品体积mL：介质体积mL）。例如1g聚合物敷料需加入10mL生理盐水，确保充分溶出。提取条件需模拟体内环境：温度37℃±1℃，时间24小时±2小时，振荡频率100rpm±10rpm（促进溶出）。

提取后需立即处理：用0.22μm聚醚砜（PES）滤膜过滤除菌（避免微生物污染细胞或动物组织）；若样品含挥发性成分，需用密封容器提取，并在提取后尽快测试，防止成分流失。

固体样品的特殊制备要求

金属材料（如不锈钢、钛合金）需先去除表面氧化层或污染物：用2000目砂纸沿同一方向打磨，直至表面光洁度Ra≤0.8μm；再用75%乙醇超声清洗10分钟，去除残留金属碎屑。切割后的金属样品需用游标卡尺测量尺寸，误差≤0.1mm——例如皮肤刺激用金属圆盘需直径10mm、厚度2mm，避免压迫皮肤导致缺血性损伤。

聚合物材料（如聚乙烯、聚乳酸）需去除表面脱模剂：用无水乙醇擦拭3次，每次晾干后再进行下一步；多孔材料（如海绵敷料）因孔隙率高，需增加提取介质用量至1:20（w/v），并延长提取时间至48小时，确保孔隙内的成分充分溶出。

陶瓷材料（如氧化铝）需研磨成细粉（粒径≤5μm），避免颗粒尖锐划伤黏膜；研磨时需用玛瑙研钵，防止引入金属杂质——若用金属研钵，需用EDTA溶液清洗以去除残留金属离子。

液体样品的均一性与杂质控制

澄清液体样品（如注射液）需先测定pH值：若pH<5或>9，需用NaOH或HCl溶液调节至6-8（模拟生理pH），但需记录调节量——例如某酸性化妆水pH=4.5，需用0.1mol/L NaOH调节至pH=7.0，加入体积≤原体积的1%。

含悬浮物的液体（如含二氧化钛的防晒喷雾）需用均质机（5000rpm，10分钟）分散，确保颗粒粒径≤20μm；若分散后仍有沉淀，需用离心（5000rpm，10分钟）去除大颗粒，但需保留上清液作为测试样品——若沉淀为活性成分，则需将沉淀重新分散后测试。

挥发性液体（如乙醇基消毒水）需在密封的顶空瓶中提取，提取温度降至25℃，避免乙醇挥发导致浓度变化；测试时需用移液枪快速吸取样品，减少暴露时间。

半固体样品的均质与稳定性保持

膏霜类样品（如保湿霜）需用高速均质机（15000rpm，10分钟）均质，直至形成均一的乳状液，无肉眼可见的油相或水相分离；均质温度需控制在25℃以下，防止热敏性成分（如维生素C）分解——若样品含蜡质，可稍微加热至40℃（蜡质熔点以下），均质后立即冷却至室温。

凝胶类样品（如芦荟胶）需检查黏度：若黏度太高（>1000mPa·s），需用提取介质稀释至500mPa·s（模拟涂抹时的流动性），稀释比例需记录（如1:1 v/v）；热敏性凝胶（如含透明质酸的面膜精华）需在4℃下均质，避免温度升高导致凝胶降解。

含颗粒的半固体（如含氧化锌的婴儿爽身粉）需确保颗粒均匀分散：用激光粒度仪测定粒径分布，D90≤10μm；若颗粒聚集，需加入少量分散剂（如吐温-80，浓度≤0.1%），但需确认分散剂本身无刺激性（通过阴性对照验证）。

生物材料浸提液的无菌处理要求

细胞模型刺激性测试（如MTT法）对无菌要求极高，浸提液需通过0.22μm滤膜过滤除菌——滤膜材质需与样品兼容：含蛋白的浸提液用PES滤膜（不吸附蛋白）；含有机溶剂的浸提液用聚四氟乙烯（PTFE）滤膜（耐溶剂）。过滤前需用提取介质润洗滤膜3次，去除滤膜上的杂质。

动物模型测试（如兔眼刺激试验）的浸提液若无法过滤（如含大颗粒），需用高压灭菌（121℃，15分钟），但需先确认样品不会被高温破坏：例如胶原蛋白海绵的浸提液不能高压灭菌，会导致蛋白变性，只能用过滤除菌。

无菌处理后需进行微生物检查：取1mL浸提液接种于营养琼脂平板，37℃培养24小时，若无菌落生长则合格；若有菌落，需重新制备浸提液并查找污染源（如提取介质未灭菌、滤膜失效）。

阴性与阳性对照样品的制备规范

阴性对照需与测试样品的提取条件完全一致：例如测试样品用1:10生理盐水提取，阴性对照就是10mL生理盐水本身，同样经过37℃、24小时振荡、过滤除菌。阴性对照的作用是验证提取介质本身无刺激性——若阴性对照导致刺激，说明介质被污染或条件不当，需重新试验。

阳性对照需选择已知刺激性的物质，常用1%十二烷基硫酸钠（SDS）溶液（皮肤刺激）、0.1%苯扎溴铵（眼刺激）。阳性对照的制备需精确：称取1g SDS，加入100mL生理盐水，搅拌至完全溶解（避免有颗粒）；若SDS难溶，可加热至40℃，但冷却至室温后需检查是否有沉淀，若有则过滤去除。

阳性对照的浓度需准确：用移液器吸取1mL阳性对照溶液，加入9mL生理盐水，稀释至0.1%（眼刺激用），并记录稀释比例；阳性对照的刺激性需符合标准——例如1% SDS的皮肤刺激评分应在3-5分（根据Draize法），若评分过低，说明SDS失效或浓度不准确，需更换。

样品标识与溯源管理

每个样品需贴唯一标识，内容包括：样品名称（如“钛合金髋关节假体”）、批号（如“20230501”）、制备日期（2023-05-05）、提取条件（37℃，24小时，1:10生理盐水）、操作者（张三）。标识需用防水标签，避免在提取过程中脱落。

溯源记录需包括所有操作细节：固体样品的切割时间（2023-05-05 09:00）、研磨次数（3次，每次5分钟）、提取介质的批号（生理盐水，批号20230401）、振荡频率（100rpm）、过滤时间（2023-05-06 09:30）。溯源记录需用电子表格保存，便于查询——例如若某样品的刺激评分异常高，可回溯到提取时间是否延长，导致更多成分溶出。

样品存储需符合条件：提取物需在4℃冰箱保存，有效期24小时；固体样品需在干燥器中保存，避免吸潮；液体样品需密封，避免挥发。存储时需将样品与对照品分开，避免混淆。