生物相容性检测中溶血试验的操作规范和判定标准

溶血试验是生物相容性检测中评估医疗器械或生物材料对红细胞膜完整性影响的核心试验，直接反映材料是否会引发溶血反应。其通过检测红细胞破坏释放的血红蛋白含量，计算溶血率以判断材料的血液相容性。本文围绕溶血试验的操作规范与判定标准展开，详细梳理试验原理、样本处理、操作控制、结果计算及判定等关键环节，为试验的标准化实施提供参考。

溶血试验的试验原理与样本要求

溶血试验的核心原理是：当生物材料或其浸提液破坏红细胞膜的完整性时，血红蛋白会从红细胞内释放至周围介质中。通过分光光度计测定介质中血红蛋白的吸光度（通常选545nm或570nm波长，对应血红蛋白的最大光吸收峰），可间接计算红细胞的溶血程度。试验中，样本处理直接影响结果可靠性，要重点控制材料浸提液制备与红细胞悬液制备两个关键环节。

材料浸提液制备需根据材料形态（固体、液体、多孔）选合适浸提介质——常用生理盐水（模拟体内细胞外液）或含血清培养基（模拟复杂体内环境）。浸提条件要严格按标准（如ISO 10993-12）：一般用材料与介质的面积/体积比（1cm²/mL）或质量/体积比（0.1g/mL），37℃恒温孵育24小时，让材料可溶性成分充分释放。浸提后用3000rpm离心10分钟或过滤去除杂质，避免干扰比色。

红细胞悬液制备常用健康家兔血或人静脉血（符合伦理），抗凝剂优先选肝素（避免EDTA破坏红细胞膜）。全血先1500g离心10分钟去血浆与白细胞层，红细胞沉淀用生理盐水洗3次（每次离心弃上清），直到上清无色透明，去除残留血红蛋白与抗凝剂。最后用生理盐水稀释到2%~5%浓度（按标准调整），稀释后轻轻颠倒混匀，避免凝集。

要注意红细胞悬液浓度稳定：浓度过高会让吸光度超分光光度计线性范围，过低会降低试验灵敏度。试验前最好用血细胞计数板或血红蛋白定量法验证浓度，确保符合要求。

试验前的试剂与设备准备

溶血试验的试剂与设备需提前核对并校准，避免因试剂失效或设备误差导致结果偏差。核心试剂包括：生理盐水（阴性对照与红细胞稀释液）、蒸馏水（阳性对照，可完全破坏红细胞膜）、肝素钠（抗凝剂）、新鲜红细胞悬液。试剂要检查有效期：生理盐水无浑浊、无絮状物；蒸馏水用电导率仪测，电导率<1μS/cm；抗凝剂现配现用，避免活性降低。

关键设备包括：离心机（校准转速与时间，确保离心力稳定）、分光光度计（提前预热30分钟，用空白调零，验证波长准确）、恒温水浴箱（温度波动±0.5℃内）、移液器（校准容量，误差≤1%）、无菌试管（提前灭菌，避免微生物污染）。

试验要在生物安全柜内做，避免颗粒物或微生物污染。接触红细胞的器具预温到37℃，避免低温导致凝集——若红细胞悬液凝集，要重新制备，不能强行混匀，否则会破坏细胞膜。

阴性与阳性对照的设置要点

对照是试验的“基准线”，直接影响结果准确。阴性对照（NC）用生理盐水（渗透压与红细胞一致，无溶血作用）；阳性对照（PC）用蒸馏水（低渗透压破坏红细胞膜，释放全部血红蛋白）。

对照要遵循“平行原则”：每个试验组对应3个以上平行对照。比如5个材料样本，阴、阳性对照各做3个平行管。对照管操作要和试验组一致：加相同体积介质，再加相同体积红细胞悬液，同条件孵育离心。

要注意阳性对照吸光度：若低于0.8，说明红细胞浓度低或蒸馏水污染，需重制；阴性对照吸光度高于0.1，说明生理盐水有溶血物质或红细胞自身溶血，要换试剂重测。

试验操作的关键步骤控制

操作要按“时间顺序”与“条件一致”执行，核心步骤是加样、孵育、离心、比色。加样时先加浸提液或对照介质（1mL），再慢加红细胞悬液（0.2mL），避免冲击管壁导致机械破坏。加完轻轻颠倒3次，混匀即可，不能剧烈振荡。

孵育用37℃水浴箱，时间60分钟（±5分钟），结束立即离心——1000g离心10分钟。离心力小会让红细胞沉淀不完全，上清残留红细胞；离心力大则破坏细胞膜，导致假阳性。

离心后用移液器吸上清（别吸到沉淀），转移到比色杯。比色要10分钟内完成——放置久了血红蛋白氧化，吸光度下降。比色杯用蒸馏水冲3次，擦镜纸擦干外壁，避免指纹影响光透过率。

溶血率的计算方法

溶血率是核心指标，公式按ISO 10993-4：溶血率（%）=（试验组吸光度-阴性对照吸光度）/（阳性对照吸光度-阴性对照吸光度）×100%。试验组吸光度是浸提液与红细胞孵育后的上清吸光度；阴性对照是生理盐水与红细胞孵育的吸光度（正常释放量）；阳性对照是蒸馏水与红细胞孵育的吸光度（100%溶血）。

计算要注意：平行样本取平均值，减少误差——若变异系数>5%，要重测；阳性减阴性的差值<0.3，说明试验无效，查红细胞浓度或对照设置；试验组吸光度低于阴性，溶血率计为0%。

比如试验组吸光度0.25，阴性0.10，阳性0.80，溶血率=（0.25-0.10）/（0.80-0.10）×100%≈21.4%。

结果判定的核心标准

结果判定按国际/国内标准：溶血率<5%，判定“无溶血作用”，符合生物相容性；≥5%则“有溶血作用”，不符合。这个阈值的依据是：体内红细胞自然溶血率0.5%~2%，5%是考虑试验误差后的安全线。

要注意不同标准的差异：GB/T 16886.4与ISO 10993-4一致；ASTM F756标准是<2%合格——试验前要明确用哪个标准，避免判定错。

结果还要看平行样本一致性：若溶血率变异系数>10%，说明重复性差，要找原因（比如样本处理不均、操作误差）重测。

试验中的常见干扰因素及排除

常见干扰要提前排除，避免影响结果。① 材料可溶性色素：若材料有染料，浸提液带颜色，导致吸光度假高。排除方法：加“材料浸提液空白对照”（浸提液+生理盐水，不加红细胞），用试验组吸光度减空白，消除色素干扰。

② 金属离子释放：材料含铜、铁等，会催化血红蛋白氧化，吸光度下降。排除方法：用不含金属的浸提容器（如聚丙烯），或加EDTA螯合金属，但要验证EDTA对红细胞无影响。

③ 红细胞凝集：材料带正电荷（如阳离子聚合物），会让红细胞凝集，上清吸光度低。排除方法：红细胞悬液加0.1%~0.5%牛血清白蛋白（BSA）中和电荷，或调浸提液pH到7.2~7.4（和血液一致）。

④ 微生物污染：样本或试剂被细菌污染，细菌产溶血素破坏红细胞，导致溶血率假高。排除方法：试剂无菌处理，器具灭菌，生物安全柜内操作，孵育时密封试管。