生物类似药临床前性能验证的可比性研究关键步骤

生物类似药是指在质量、安全性和有效性上与参照药高度相似的生物制品，其开发核心是通过“可比性研究”构建相似性证据链。临床前性能验证作为证据链的基础，需系统对比二者在分子特征、生物学活性、杂质谱等关键维度的一致性——这些步骤直接决定临床研究设计的合理性，也是监管评估“可替代性”的核心依据。本文聚焦临床前可比性研究的关键步骤，拆解技术要点与实践逻辑。

参照药的选择与基准建立

参照药是可比性研究的“金标准”，需满足三个条件：一是原研生物制品（如ICH地区上市的原研药）；二是质量稳定（未发生重大工艺变更）；三是可获得多批次（至少3批）以覆盖变异。例如开发抗HER2单抗生物类似药时，需选原研药的美国上市批次，而非区域适应性变更后的版本。

基准建立的核心是明确参照药的“关键质量属性（CQA）”——即对疗效、安全性有直接影响的特征，如单抗的分子完整性、糖基化修饰、生物学活性等。这些属性需通过多批次检测统计得出，比如参照药3批的聚合体含量为1.2%~1.8%，则生物类似药需落在该区间内，避免单批次的偶然性。

若仅用1批参照药，可能导致生物类似药质量范围被错误缩小。比如某参照药单批次聚合体1.0%，生物类似药按此开发，但原研药实际变异到1.8%，则生物类似药的聚合体含量可能低于参照药下限，影响可比性结论。

分子结构与理化特性的对比

分子结构相似性是基础，需从一级到高级结构逐层验证。一级结构用肽图分析（HPLC-MS）：将参照药与生物类似药酶解后，对比肽段的色谱保留时间与质谱鉴定结果，要求氨基酸序列100%一致（除非翻译后修饰差异可接受，如N端甲硫氨酸切除）。

高级结构用光谱学方法：二级结构用圆二色谱（CD），β折叠、α螺旋的特征峰位置需一致，强度差异≤5%；三级结构用氢氘交换质谱（HDX-MS），交换图谱重叠度≥90%说明结构相似；四级结构（如单抗二聚体）用分析超速离心（AUC）验证聚合体含量一致。

理化特性需对比可量化参数：等电点用毛细管等电聚焦（cIEF），差异≤0.1pH单位；分子量用MALDI-TOF MS，相对差异≤0.5%；疏水性用反相HPLC，保留时间差异≤2%。这些参数微小差异可能影响溶解度或体内行为，需严格控制。

生物学活性的可比性评价

生物学活性直接关联疗效，需验证“结合活性”与“功能活性”。结合活性用表面等离子体共振（SPR）测靶点亲和力，如抗TNF-α单抗的KD值，要求生物类似药与参照药比值在0.8~1.25（差异≤25%）。

功能活性需匹配作用机制：抗HER2单抗用细胞增殖抑制 assay，测EC50比值0.8~1.25；抗CD20单抗用ADCC assay，通过LDH释放法检测细胞毒性，要求活性无统计学差异。

活性测定的关键是方法验证： assay需能区分参照药10%以内的差异（灵敏度），intra-assay CV≤10%（精密度），覆盖参照药活性范围（线性）。比如某干扰素的病毒抑制 assay，需验证能区分90%与110%的活性差异，避免遗漏微小变化。

杂质谱的一致性分析

杂质关联安全性，需对比“产品相关杂质”（降解产物、聚合体）与“工艺相关杂质”（HCP、残留DNA）。产品相关杂质中，片段用还原型CE-SDS检测，要求含量≤参照药均值+2倍标准差；聚合体用SEC检测，≤参照药上限（如参照药平均1.5%，则生物类似药≤2.1%）。

工艺相关杂质中，HCP用ELISA或LC-MS/MS检测，要求≤100ppm且无新杂质；残留DNA用qPCR≤10ng/剂；Protein A残留用ELISA≤10ppm。若出现新杂质，需溯源工艺：如某生物类似药检测到未切除的甲硫氨酸轻链，需优化发酵的甲硫氨酸酶活性消除该杂质。

杂质谱要求“质一致、量相当”——生物类似药可含参照药相同杂质，只要含量在安全范围。比如参照药HCP50~150ppm，生物类似药80ppm虽高于均值，但在变异范围内，可接受。

稳定性的平行性验证

稳定性影响货架期，需做长期、加速与强制降解试验。长期稳定性模拟储存条件（如2~8℃），检测12个月内的外观、pH、纯度、活性：若参照药12个月聚合体从1.0%增至1.8%，生物类似药从1.1%增至1.7%，说明降解速率一致。

加速稳定性（40℃/75%RH）预测长期行为，6个月后聚合体增加量需与参照药一致；强制降解（高温、低pH）分析降解途径：若二者降解产物种类、比例一致，说明降解机制相同。

配伍稳定性也需验证：如单抗用0.9%氯化钠稀释后，6小时内聚合体含量需与参照药一致（如参照药1.5%，生物类似药1.4%），确保临床使用安全。

工艺与质量的关联验证

工艺是质量的源头，需验证参数变化不影响质量。比如发酵温度影响糖基化：若参照药发酵37℃，生物类似药36℃，需验证岩藻糖含量仍在参照药范围（85%~95%）；若温度降至35℃导致岩藻糖降至80%，需调整温度至36.5℃。

纯化工艺的关键是“去除能力”：如Protein A柱穿透率升高会增加HCP，需验证穿透率在10%以内时，HCP≤100ppm（与参照药一致）。若穿透率达15%导致HCP升至120ppm，需增加洗涤缓冲液体积。

工艺一致性不要求“完全相同”，而是“影响一致”。比如参照药用“蛋白A+阳离子交换”，生物类似药用“蛋白A+阴离子交换”，只要最终质量一致，路线差异可接受。

关键质量属性的动态监控

关键质量属性（CQA）需用FMEA或QbD识别——如抗PD-1单抗的岩藻糖含量影响ADCC活性，是CQA；C端赖氨酸截除对活性无影响，不是CQA。识别后需动态监控：发酵阶段监控细胞密度，影响糖基化；纯化阶段监控Protein A柱穿透率，影响HCP。

监控的核心是“控制策略”：若岩藻糖含量可接受范围80%~90%，某批次降至75%，需排查发酵锰离子浓度（锰离子低会降低岩藻糖），补充锰离子恢复。

CQA需动态更新：若临床I期发现“高甘露糖型糖链”影响清除率，即使参照药未列CQA，也需纳入后续研究，确保可比性证据完整。