药品无菌检查中微生物检测的操作规范有哪些

药品无菌检查是确保注射剂、眼用制剂等无菌药品安全性的核心质量控制环节，其中微生物检测的操作规范直接决定结果的准确性与可靠性——操作不当可能导致假阴性（漏检污染菌）或假阳性（误判合格样品），最终影响药品能否上市或患者用药安全。本文结合《中国药典》（2020版）、GMP及ISO 11137等标准，详细梳理无菌检查中微生物检测的核心操作规范，聚焦“怎么做、为什么这么做”的实操细节。

环境与设施的无菌保障要求

微生物检测需在“受控洁净环境”中进行，通常采用“D级背景+A级单向流”或“B级洁净区”（对应《中国药典》附录ⅪH的要求）。实际操作中，环境需定期监测3项关键指标：空气洁净度（浮游菌≤1CFU/m³、沉降菌≤1CFU/4小时，均针对A级区）、表面微生物（工作台面用接触碟采样，菌落数≤1CFU/25cm²）、人员手卫生（用75%乙醇消毒后，手表面菌落数≤1CFU/cm²）。

人员着装也需严格合规：需穿经121℃高压灭菌的无菌服（覆盖头发、面部、手腕），戴无粉乳胶手套（手套需贴合指尖，避免操作时滑落），进洁净区前需通过“风淋”去除体表浮尘，操作过程中不得随意触摸面部或调整口罩——这些细节是防止“人员带入污染”的关键。

试剂与培养基的验证及使用规范

培养基是微生物生长的“土壤”，使用前必须做“适用性检查”：一是促生长试验（接种金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、白色念珠菌各10-100CFU，培养后需明显浑浊），二是抑制试验（针对含抗生素的样品，需验证培养基能中和样品的抑菌作用——如检测青霉素类样品时，培养基需加β-内酰胺酶）。

试剂的无菌性同样重要：无菌水需用0.22μm微孔滤膜过滤除菌，储存于带透气盖的无菌瓶中，每周更换1次并做无菌检查；稀释液（如0.9%氯化钠溶液）需经121℃高压灭菌15分钟，使用前摇晃检查有无沉淀——若稀释液浑浊，说明已污染，需立即丢弃。

样品前处理的剂型适配原则

不同剂型的样品需用不同方法释放微生物：注射剂（如葡萄糖注射液）可直接取10ml接种；无菌粉末（如头孢唑林钠）需用pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液溶解（1g样品加10ml缓冲液），超声5分钟助溶（需验证超声不杀死微生物）；油剂（如维生素D注射液）需加等量聚山梨酯80乳化（40℃水浴振荡10分钟），使油滴分散成小颗粒，便于微生物接触培养基。

需注意：难溶性样品不能用强酸强碱助溶（会杀死微生物），需用“生理兼容型”稀释液——如中药注射剂常用0.1%蛋白胨水，既能溶解样品，又能保护微生物活性。

接种操作的无菌细节控制

接种需在超净工作台内完成，操作前需开紫外灯消毒30分钟，通风10分钟（排走臭氧）。接种量需严格按《中国药典》：每支培养基接种1-10ml样品（固体样品1-10g），若样品体积过大（如20ml），需分2支培养基接种（每支10ml），避免培养基被样品稀释过度影响生长。

接种手法也有讲究：用无菌移液管吸样时，尖端不能碰到试管口外沿；注入培养基时要缓慢，避免产生气泡（气泡会隔绝氧气，影响需氧菌生长）；接种后立即拧紧培养基瓶盖，火焰灼烧瓶口1圈（杀死瓶口残留微生物）。

培养条件的精准执行标准

培养温度和时间需“双精准”：需氧菌/厌氧菌培养温度30-35℃，真菌20-25℃；培养时间必须满14天（《中国药典》强制要求），不能提前终止。培养箱需每天记录2次温度（上午9点、下午5点），偏差不能超过±1℃——若培养箱温度升到36℃，需立即调整并重新接种（温度过高会抑制微生物生长）。

厌氧培养需用“产气袋法”：将接种好的培养基放入厌氧罐，加1袋AnaeroPack产气袋（释放氢气和二氧化碳，消耗氧气），密封后放入培养箱——需验证罐内氧气浓度≤1%（用氧指示剂检测，蓝色变白色即为厌氧）。

对照试验的必要性与操作规范

阳性对照是“验证检测有效的金标准”：需选与样品抗菌谱匹配的菌株——如检测革兰阳性菌用金黄色葡萄球菌（ATCC 6538），革兰阴性菌用大肠埃希菌（ATCC 25922），真菌用白色念珠菌（ATCC 10231）。接种量需控制在10-100CFU/支（用梯度稀释法制备：将新鲜菌株稀释至10²CFU/ml，取0.1ml接种）。

阴性对照是“排除污染的关键”：取10ml无菌水接种培养基，培养后需无任何生长——若阴性对照浑浊，说明操作或培养基污染，所有样品结果无效，需重新检测。

结果判定的严谨性操作

培养期间需每天观察：若样品管浑浊，先别急着判阳性——需做3步验证：①涂片镜检（革兰染色，看有无微生物）；②转种平板（取浑浊液接种营养琼脂，培养24小时看菌落）；③确认微生物来源（若转种后有菌落，需鉴定菌的种类，判断是样品污染还是操作污染）。

需注意：有些样品本身会浑浊（如中药注射剂的鞣质沉淀），这时需用“滤膜法”确认——将样品经0.45μm滤膜过滤，滤膜贴平板培养，若无菌落，说明是样品本身浑浊，可判为阴性。

异常情况的追溯与处理

若样品管阳性，需先查“污染链”：是操作时手碰了样品管？还是培养基过期？还是样品本身带菌？若查不出原因，需重新取同批次样品检测——2次检测都阳性，才能判样品不合格。

若阳性对照不生长，需检查：菌株是不是冻存太久（活力下降）？接种量是不是太少（<10CFU）？培养基是不是失效（促生长成分破坏）？——解决问题后，重新做对照试验，直到阳性对照生长，才能继续检测样品。