化妆品毒理测试中的眼刺激性测试评分标准（Draize法）详解

Draize眼刺激性测试是化妆品毒理安全评估中最经典的眼刺激评价方法，由美国FDA的John H、Draize于1944年提出。该方法通过将受试物滴入健康白兔结膜囊，观察角膜、虹膜及结膜的刺激反应，以量化评分评估物质对眼部的潜在伤害。其核心是基于眼部组织病理表现，建立“无反应-严重损伤”的梯度标准，为化妆品是否符合安全要求提供关键数据——至今仍是全球法规（如FDA、欧盟CLP）认可的基础测试方法。

Draize测试的实验设计：从动物选择到观察流程的标准化

Draize测试的动物选择需严格匹配“敏感且可观察”的要求：通常选用8-12周龄、体重1.8-2.2kg的新西兰白兔（或白化兔），因白兔眼部组织（结膜、虹膜）颜色浅，充血、混浊等反应更易识别。实验前需对动物进行3-5天适应性饲养，同时做眼部基线检查——若某只兔眼存在自发充血或角膜斑点，需直接剔除，避免干扰结果。

给药操作需精准控制剂量与部位：液态受试物取0.1ml（约1滴），用移液器缓慢滴入下结膜囊（避免直接滴在角膜上，防止假阳性）；固态受试物取50mg，用眼科镊轻放于结膜囊内，随后闭合眼睑1-2秒，确保受试物与黏膜充分接触。需注意，过度挤压眼睑会导致受试物流出，或损伤眼组织，因此需用专用固定箱固定动物，仅暴露眼部。

观察时间点需覆盖“反应周期”：给药后1小时（即时反应）、24小时（急性峰值）、48小时（消退初期）、72小时（稳定期）需重点观察，之后每天随访至反应完全消失（最长14天）。例如，某爽肤水的酒精成分可能在1小时导致结膜发红，24小时红肿加重，48小时开始消退，72小时恢复正常——需记录24小时的最高反应，而非72小时的恢复状态。

对照设置是结果可靠性的关键：需同时做空白对照（生理盐水）和溶剂对照（如受试物的乙醇溶剂），以区分“受试物本身的刺激”与“溶剂的刺激”。例如，若溶剂对照的结膜评分为2分，受试物的结膜评分为5分，则受试物的实际刺激为5-2=3分（扣除溶剂影响）。

动物护理需避免二次损伤：实验期间，若动物因刺激频繁抓挠眼部，需佩戴伊丽莎白圈；若受试物导致眼部分泌物过多，需用温生理盐水棉签轻轻擦拭（避免用力摩擦结膜），确保观察清晰。

眼刺激评估的核心：角膜、虹膜与结膜的功能差异

Draize法选择角膜、虹膜、结膜作为核心指标，是因为这三个组织覆盖了眼部从外到内的结构，且各自的反应能反映不同层次的损伤：角膜是屈光核心（损伤影响视力），虹膜是眼内屏障（反应提示刺激渗透深度），结膜是黏膜屏障（敏感反映表面刺激）。三者的反应共同构成“眼刺激全景图”。

角膜的结构决定其对刺激的敏感性：角膜由上皮层、前弹力层、基质层、后弹力层和内皮层组成，其中上皮层最易受刺激——表面活性剂（如十二烷基硫酸钠）会破坏上皮细胞的紧密连接，导致水分渗入基质层，引发混浊。基质层的损伤更严重，可能形成永久性瘢痕（如强酸强碱灼伤）。

虹膜的反应关联眼内炎症：虹膜富含血管和神经，刺激会导致血管扩张（充血）、组织肿胀（压迫瞳孔括约肌），甚至瞳孔对光反射消失。例如，某染发剂中的氨成分可能穿透角膜，刺激虹膜，导致瞳孔无法缩小（提示眼内炎症）。

结膜的黏膜特性使其成为“第一道防线”：结膜含有丰富的毛细血管和黏液腺，刺激会引发“三重反应”——毛细血管扩张（充血发红）、组织液渗出（水肿肿胀）、黏液分泌增加（分泌物增多）。这些反应是机体的防御机制，但过度反应会导致眼睑闭合、视力模糊（如重度结膜炎）。

实际测试中，三者常同时反应：比如某祛痘膏的水杨酸成分，可能导致角膜轻微混浊（角膜评分2分）、虹膜轻度充血（虹膜1分）、结膜明显发红（结膜2分），总评分5分，属于轻度刺激。

角膜损伤的评分：混浊程度×受累面积的梯度判定

角膜是Draize评分中权重最高的指标（占比约60%），因为其损伤直接关系到视力。评分逻辑是“严重程度×范围”——混浊程度越重、受累面积越大，评分越高。混浊程度的判定以“虹膜可见性”为核心：

0分：角膜完全透明，能清晰看到虹膜的放射状纹理和瞳孔边缘；1分：轻微混浊（不易察觉），需凑近或用放大镜才能看到，虹膜仍清晰；2分：明显混浊（易察觉），但虹膜细节（如瞳孔括约肌）仍可辨；3分：中度混浊，虹膜纹理模糊，只能看到大致轮廓；4分：重度混浊，虹膜完全被遮挡，看不到任何细节（如瞳孔）。

受累面积按角膜的比例划分：0分（无）、1分（＜1/4）、2分（1/4-1/2）、3分（1/2-3/4）、4分（＞3/4）。例如，若受试物导致角膜1/2面积出现“中度混浊”（3分），则角膜评分为3×2=6分；若全角膜“重度混浊”（4分×4分），则评分为16分（最大值）。

观察角膜需注意“动态变化”：有些刺激可能在24小时达到峰值，之后逐渐恢复（如轻度表面损伤）；有些则会持续加重（如强酸灼伤）。例如，某眼线笔的黑色颗粒可能在24小时导致角膜1/4面积“轻度混浊”（2分），48小时后混浊消失——需记录24小时的最高评分（2×1=2分），而非48小时的0分。

避免误判的技巧：用裂隙灯显微镜检查角膜深层（如基质层），若混浊仅出现在上皮层（可通过荧光素染色确认：上皮损伤会染成绿色），则多为可逆性；若基质层混浊（无荧光素染色），则可能留下瘢痕（不可逆）。

虹膜反应的评分：充血、肿胀与瞳孔反射的综合判断

虹膜的评分关注“刺激的深度与可逆性”，分为0-2分：0分（无反应）、1分（轻度充血/肿胀，但瞳孔对光反射正常）、2分（重度反应：充血肿胀明显，或瞳孔反射消失，或有脓性渗出）。

瞳孔反射是虹膜评分的关键：用手电筒快速照射眼晴，若瞳孔能迅速缩小（＜1秒），则反射正常；若缩小缓慢或无反应，则为异常。例如，某香水的香精成分可能穿透角膜，刺激虹膜，导致瞳孔反射消失——此时虹膜评分为2分。

虹膜反应的“可逆性”很重要：若2分反应在72小时内恢复（瞳孔反射重新出现），则刺激为“一过性”；若72小时后仍无反射，提示眼内炎症未消退（需延长观察至14天）。

需注意的细节：虹膜的“渗出物”需与“分泌物”区分——渗出物是眼内炎症产生的脓性物质（粘在虹膜表面），分泌物是结膜分泌的黏液（位于眼睑边缘），前者提示更严重的眼内刺激。

结膜刺激的评分：充血、水肿与分泌物的三维叠加

结膜是最敏感的表面指标，评分由“充血、水肿、分泌物”三个独立维度相加（0-9分），每个维度0-3分：

充血（发红）：0分（无）、1分（轻微，淡粉色）、2分（明显，红色）、3分（重度，深红色/紫红色）；水肿（肿胀）：0分（无）、1分（轻微，眼睑无下垂）、2分（中度，眼睑下垂＜1/2）、3分（重度，眼睑闭合或下垂≥1/2）；分泌物：0分（无）、1分（少量清稀黏液）、2分（中等量，粘住眼睑）、3分（大量，脓性或结痂）。

例如，某面霜导致结膜“明显发红”（2分）、“眼睑半垂”（2分）、“中等量黏液”（2分），则结膜评分为2+2+2=6分。需注意，分泌物的“性质”比“量”更重要：脓性分泌物（黄色/绿色）提示细菌感染（更严重），清稀黏液多为刺激性反应（可逆）。

观察结膜需避免“人为充血”：若固定动物时过度压迫颈部，会导致结膜毛细血管扩张（假阳性发红），因此需待动物安静后再观察（通常等待5分钟）。

结膜反应的“时效性”：有些刺激（如辣椒素）会在1小时内导致重度充血，但24小时后完全恢复；有些（如防腐剂）则会持续刺激，48小时后仍有水肿——需记录每个时间点的最高值。

总评分计算与刺激强度分级

Draize总评分=角膜评分+虹膜评分+结膜评分（范围0-27分），根据总分可将眼刺激性分为四级：

无刺激（≤3分）：受试物无任何眼部反应，或反应极轻微（如结膜轻微发红，1小时内消失）；轻度刺激（4-10分）：有明显但可逆的反应（如角膜轻微混浊，24小时恢复）；中度刺激（11-25分）：反应较严重（如角膜中度混浊，72小时内恢复）；重度刺激（≥26分）：反应剧烈且不可逆（如全角膜混浊，14天未恢复）。

例如，某洗发水的测试结果：角膜评分8分（中度混浊，1/2面积）、虹膜2分（瞳孔反射消失）、结膜7分（重度充血+中度水肿+少量分泌物），总评分17分，属于中度刺激——需进一步评估其在化妆品中的使用浓度（如稀释后是否降低刺激）。

需注意，不同法规的分级标准略有差异：欧盟CLP分类将“重度刺激”定义为“导致角膜混浊持续≥7天”，美国FDA则更关注“72小时内的最高反应”，但核心逻辑一致——总分越高，刺激越强。

评分准确性的保障：规范操作与人员培训

Draize评分的主观性较强（如“轻微混浊”的判断因人而异），需通过以下方式降低误差：

1、标准化培训：观察人员需学习“评分指南”（带图片示例，如不同混浊程度的兔眼照片），并通过考核（如判断10张兔眼图片的评分，正确率≥90%方可上岗）；2、双盲观察：由两名独立人员分别评分，取平均值（若差异＞2分，需第三方复核）；3、记录细节：不仅记录评分，还要描述具体反应（如“角膜1/4面积淡灰色混浊，虹膜清晰”），便于追溯；4、重复实验：同一受试物需做3-6只动物的测试，取中位数（避免单只动物的个体差异）。

例如，某口红的提取物测试中，甲人员评分为5分，乙人员评分为7分，差异2分——需第三方观察，最终取6分（中位数）。

此外，需关注“动物福利”：若受试物导致动物重度痛苦（如眼睑闭合、频繁抓挠），需提前终止实验（用生理盐水冲洗眼部，或 euthanasia），符合3R原则（减少、替代、优化）。