化妆品毒理测试中的遗传毒性测试常用的检测方法有哪些类型

遗传毒性测试是化妆品毒理安全评估的核心环节之一，主要用于检测原料或成品是否具有致突变性——即损伤遗传物质（DNA、染色体）并可能引发基因突变、染色体畸变的潜在风险。作为化妆品合规上市的必要门槛，这类测试需遵循国际化妆品监管联盟（ICCR）、中国《化妆品安全技术规范》等标准，常用方法可分为体外细菌/细胞试验与体内动物试验两大类，覆盖不同遗传损伤机制的检测需求。

细菌回复突变试验（Ames试验）：体外点突变的经典初筛法

细菌回复突变试验又称Ames试验，是遗传毒性测试中最成熟、应用最广泛的体外方法，核心原理是利用营养缺陷型沙门氏菌突变体——这些细菌因组氨酸合成基因（his）突变，无法自行合成组氨酸，只能在添加组氨酸的培养基中生长。若受试物能诱导his基因“回复突变”（即恢复合成组氨酸的功能），突变体就能在无组氨酸的选择培养基上形成菌落，菌落数量与受试物的致突变性呈正相关。

试验需设置两个关键变量：一是“代谢活化系统（S9混合液）”——由大鼠肝脏匀浆离心得到，含细胞色素P450酶等代谢酶，用于模拟人体肠道吸收后经肝脏代谢的过程（许多化妆品原料如某些香料、防晒剂，原型无毒性，但代谢后会产生致突变代谢物）；二是“剂量梯度”——通常设置5-7个剂量组，覆盖从低到高的浓度范围，以观察剂量-反应关系。

在化妆品测试中，Ames试验的优势在于操作简便、成本低、灵敏度高，能快速检测“点突变”（DNA分子中单个碱基的替换、插入或缺失）风险，因此成为原料“初筛”的首选。例如，化妆品中常用的防腐剂甲基异噻唑啉酮（MIT）、表面活性剂椰油酰胺丙基甜菜碱，都需先通过Ames试验排除点突变风险，再进入后续试验。

需注意的是，Ames试验仅能检测细菌的点突变，无法反映染色体畸变或哺乳动物细胞的遗传损伤，因此需与其他方法联合使用，才能全面评估风险。

体外哺乳动物细胞HPRT基因突变试验：X染色体基因的点突变检测

体外哺乳动物细胞基因突变试验中，HPRT试验是针对X染色体基因的经典方法。HPRT基因（次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因）位于X染色体上，编码的酶参与嘌呤的补救合成——正常细胞能利用HPRT酶将外源性次黄嘌呤转化为IMP（次黄嘌呤核苷酸），进而合成DNA。

试验原理基于“耐药性筛选”：当HPRT基因发生点突变或小片段缺失，导致酶功能丧失，细胞无法利用外源性次黄嘌呤，此时若加入“6-硫代鸟嘌呤（6-TG）”——一种嘌呤类似物，会被正常HPRT酶催化整合到DNA中，导致细胞死亡——突变细胞因无法合成HPRT酶，会对6-TG产生耐药性，从而存活并形成克隆。

常用的细胞株是中国仓鼠卵巢细胞（CHO）或V79细胞（中国仓鼠肺细胞），因为这些细胞株的HPRT基因序列明确，自发突变率低（通常<1×10⁻⁶）。试验需设置“加S9”与“不加S9”两组，模拟体内代谢过程——例如，化妆品中的某些香料成分（如香豆素），需经S9代谢后才会诱导HPRT基因突变。

HPRT试验的优势在于基因位于X染色体，呈半合子状态（男性细胞）或“功能半合子”（女性细胞，X染色体随机失活），因此突变会直接表现为耐药性，无需考虑等位基因的掩盖。但缺点是HPRT基因长度较短（约40kb），无法检测大的染色体片段缺失，因此需与其他试验联合使用。

体外哺乳动物细胞TK基因突变试验：常染色体基因的广泛突变检测

与HPRT试验不同，TK试验的靶基因（胸苷激酶基因）位于常染色体上（如CHO细胞的1号染色体），基因长度更长（约20kb），因此能检测点突变、小片段缺失等更广泛的突变类型。TK酶参与胸苷的补救合成，将胸苷转化为TMP（胸苷一磷酸），用于DNA合成。

试验原理：正常细胞的TK基因功能正常，会被“5-溴脱氧尿苷（BrdU）”或“三氟胸苷（TFT）”抑制生长（这些物质是胸苷类似物，会被TK酶催化整合到DNA中）；若TK基因发生突变，细胞对这些药物产生耐药性，就能在含药培养基中存活。常用的细胞株是CHO-K1细胞或V79细胞。

在化妆品测试中，TK试验常用于Ames试验结果不明确的原料——例如，某款新型植物提取物Ames试验呈弱阳性，TK试验能进一步验证其是否在哺乳动物细胞中诱导突变。此外，由于TK基因位于常染色体，杂合子突变（仅一个等位基因突变）也会导致酶功能降低，因此试验灵敏度高于HPRT试验。

需注意的是，TK试验的自发突变率高于HPRT试验（通常<5×10⁻⁶），因此需严格控制试验条件（如细胞传代次数、血清质量），确保背景突变率在可接受范围内。

体外哺乳动物细胞染色体畸变试验：染色体结构与数目异常检测

若说前两类试验针对“基因水平”的突变，体外哺乳动物细胞染色体畸变试验则聚焦于“染色体水平”的损伤——包括染色体结构异常（如断裂、易位、缺失、重复）和数目异常（如多倍体、非整倍体）。这类损伤比点突变更严重，可能直接导致细胞死亡或癌变。

试验通常使用CHO或V79细胞，步骤包括：将细胞暴露于受试物（加或不加S9）后，加入秋水仙素（抑制纺锤体形成，使细胞停留在有丝分裂中期——此时染色体形态最清晰）；随后收获细胞、低渗处理（使染色体分散）、固定、染色（常用吉姆萨染液），最后在显微镜下观察染色体形态。

计数时需遵循严格标准：通常观察200-500个中期分裂相细胞，统计“结构畸变细胞率”（如断裂细胞数占总细胞数的比例）和“数目异常细胞率”（如多倍体细胞数）。例如，化妆品中的某些重金属（如铅、汞）或染发剂中的对苯二胺，可能诱导染色体断裂，这类试验能直接检测到。

需注意的是，自发染色体畸变率（即未暴露受试物的细胞的畸变率）需低于5%，否则结果无效——这是化妆品测试中的关键质控指标。此外，细胞培养条件（如血清浓度、培养时间）会影响结果，因此试验需严格控制变量，确保重复性。

小鼠淋巴瘤细胞MLA试验：高灵敏度的多重突变检测

小鼠淋巴瘤细胞TK基因突变试验（MLA）是一种“升级版”的体外细胞试验，使用小鼠淋巴瘤L5178Y细胞的TK基因（位于常染色体11号），能同时检测点突变、染色体缺失、重排等多种遗传损伤——这是其区别于HPRT或常规TK试验的核心优势。

原理与常规TK试验类似：正常L5178Y细胞的TK基因功能正常，会被“三氟胸苷（TFT）”抑制生长（TFT是胸苷类似物，会被TK酶催化整合到DNA中）；若TK基因发生突变，细胞对TFT耐药，就能在含TFT的培养基中存活。但由于TK基因位于常染色体，且基因长度较长（约60kb），因此不仅点突变会导致耐药，染色体片段缺失、重排（如11号染色体部分缺失）也会导致TK基因功能丧失——这使得MLA能检测更广泛的突变类型。

在化妆品测试中，MLA常用于高风险原料的评估，如某些新型防晒剂、植物提取物（成分复杂，可能含未知代谢物）。例如，某款植物来源的抗氧化剂若Ames试验阳性，MLA能进一步明确其是否诱导染色体结构损伤，为后续体内试验提供依据。

MLA的灵敏度高于常规细胞试验，但操作更复杂——需使用96孔板进行克隆形成试验，计数存活克隆数（克隆大小也需观察，因为大克隆通常对应点突变，小克隆对应染色体损伤）。因此，这类试验通常由专业毒理实验室开展，确保结果准确性。

小鼠骨髓细胞微核试验：体内染色体损伤的直观检测

体外试验虽能快速筛选，但无法模拟动物体内的代谢、排泄、组织分布等过程——例如，某些物质在体外细胞中诱导突变，但在体内会被肝脏代谢为无毒产物，或被肾脏排泄，因此需用体内试验验证其实际风险。体内遗传毒性试验是化妆品监管中的“确证性试验”，仅当体外试验阳性或需更严格评估时使用。

最常用的体内试验是小鼠骨髓细胞微核试验：原理是检测骨髓中未成熟红细胞（嗜多染红细胞）的微核——微核是染色体片段或完整染色体，因纺锤体异常无法纳入细胞核，最终被排除在主核外形成的小体。试验时，将受试物经口或皮肤涂抹（模拟化妆品实际使用方式）给予小鼠，24-48小时后取骨髓，制片染色，计数1000个嗜多染红细胞中的微核数。

该试验的优势在于直接反映体内染色体损伤——骨髓是造血组织，细胞分裂活跃，对染色体损伤敏感；而嗜多染红细胞无核膜，微核更易观察。例如，某款含铅的化妆品原料若体外染色体畸变试验阳性，微核试验能验证其在体内是否真的诱导染色体损伤。

试验需注意“剂量设置”：需选择能产生毒性但不导致动物死亡的剂量（通常为LD50的1/10-1/3），且每组至少10只小鼠（雌雄各半），确保统计效力。此外，阳性对照（如环磷酰胺）需产生明显的微核率升高，以验证试验系统的有效性。

大鼠肝细胞UDS试验：体内DNA修复的间接检测

另一类常用的体内遗传毒性试验是大鼠肝细胞非程序性DNA合成试验（UDS试验），用于检测肝细胞的DNA修复活动——当DNA受损伤时，细胞会启动“非程序性DNA合成”（即不依赖细胞分裂的DNA修复），通过检测这种修复合成的DNA量，可间接反映DNA损伤程度。

试验原理：将受试物给予大鼠（经口或腹腔注射）后，取出肝脏，分离肝细胞，加入³H-胸苷（放射性同位素标记的胸苷）——正常细胞在S期（DNA合成期）会摄入胸苷，但损伤细胞会在非S期启动修复合成，因此放射性标记的胸苷会整合到修复的DNA中。通过液闪计数或放射自显影法，可定量检测UDS水平（即修复合成的DNA量）。

在化妆品测试中，UDS试验适用于经皮吸收后可能到达肝脏的原料，如某些透皮剂、油脂类成分（易通过皮肤进入血液循环）。例如，某款新型油脂衍生物若体外试验阳性，UDS试验能验证其是否在体内诱导肝脏细胞DNA损伤。

UDS试验的优势在于靶向代谢主要器官（肝脏），但缺点是操作复杂——需分离原代肝细胞（不能用细胞株，因为细胞株的DNA修复能力可能改变），且放射性同位素的使用需严格遵守安全规范。因此，这类试验通常用于高风险原料的最终评估。