化妆品毒理测试中的遗传毒性测试染色体畸变试验操作要点

染色体畸变试验是化妆品遗传毒性测试的核心方法之一，旨在检测化妆品成分是否引起体细胞染色体结构或数目异常，是评估化妆品潜在遗传危害的关键环节。该试验通过观察分裂中期细胞的染色体形态，判断样品是否具有诱变活性，结果直接影响化妆品的安全评价与上市许可。本文结合实验操作中的关键环节，详细阐述染色体畸变试验的操作要点，为实验室规范开展试验提供参考。

试验体系的选择与细胞株要求

染色体畸变试验常用的细胞株以啮齿类体细胞为主，其中中国仓鼠卵巢细胞（CHO）与中国仓鼠肺细胞（CHL）是行业首选模型。这两种细胞的染色体数目少（CHO细胞2n=20，CHL细胞2n=24），染色体形态大且带型清晰，便于显微镜下观察结构畸变（如断裂、易位）与数目异常（如非整倍体），是国际化妆品监管机构（如FDA、欧盟EC）推荐的标准细胞株。

细胞株的质量需严格管控。实验前需验证细胞无支原体、细菌或病毒污染——可通过PCR法检测支原体，革兰氏染色法检测细菌。同时，染色体核型需稳定：传代次数不宜超过50代，长期传代可能导致染色体自发缺失或易位，影响试验结果的准确性。

细胞的生长状态是试验成功的基础。需选用对数生长期的细胞，此时细胞分裂活跃（分裂指数约5%-10%），对样品的毒性或诱变作用更敏感。判断对数生长期的方法：细胞汇合度达70%-80%，培养液清澈，无悬浮死细胞；台盼蓝染色法检测细胞活力≥90%。

培养条件需标准化：使用含10%胎牛血清（FBS，需热灭活）的MEM或DMEM培养基，添加1%青霉素-链霉素混合液防止污染；培养箱温度维持37℃，CO₂浓度5%，湿度≥95%。定期更换培养基（每2-3天一次），避免乳酸等代谢废物积累导致pH值下降（pH<7.0会抑制细胞分裂）。

样品的前处理与浓度设计

化妆品成分的物理状态多样，需针对性进行前处理。固体原料（如粉体、蜡质）需用适宜溶剂溶解：水溶性成分用生理盐水或培养基溶解，脂溶性成分用二甲基亚砜（DMSO）溶解，DMSO浓度需≤0.5%（过高会损伤细胞膜）。液体原料（如精华液、精油）可直接用培养基稀释，若为挥发性成分，需密封处理避免浓度降低。膏体或乳状原料（如面霜、乳液）需用乳化剂（如吐温-80，浓度≤1%）制成均匀乳悬液，超声处理5-10分钟确保分散均匀。

浓度设计需通过预试验确定。预试验的目的是找到最高测试浓度（Maximum Test Concentration, MTC）：以细胞相对增殖率（RGR）为指标，RGR=（试验组细胞数/阴性对照组细胞数）×100%，MTC为RGR=50%左右的浓度（即半数抑制浓度IC50），若样品无明显细胞毒性，MTC设为5mg/mL（固体）或5μL/mL（液体）（按OECD试验指南473要求）。

正式试验需设3-5个梯度浓度，如MTC、MTC/2、MTC/4、MTC/8，确保覆盖从高毒性到低毒性的范围。同时设置3组对照：阴性对照（溶剂对照，如含0.5%DMSO的培养基）、阳性对照1（无需代谢活化，如丝裂霉素C，浓度0.1-0.5μg/mL）、阳性对照2（需代谢活化，如环磷酰胺，浓度5-10μg/mL）。

需注意样品的稳定性：易氧化成分（如维生素C、视黄醇）需在氮气保护下处理，避免氧化失活；易降解成分（如多肽、酶类）需现用现配，处理后1小时内加入细胞培养体系。

染毒处理的时间与方式

染毒时间需根据样品是否需要代谢活化确定。无需代谢活化的样品（如直接作用于DNA的成分）采用连续染毒法：将样品加入细胞培养体系后，连续培养24小时（覆盖一个细胞周期）。需要代谢活化的样品（如需肝脏酶代谢转化为诱变物的成分）采用短期染毒加恢复培养法：染毒4小时后，去除含样品的培养基，用PBS冲洗细胞2次，加入新鲜培养基恢复培养20小时（共24小时，确保细胞进入分裂中期）。

代谢活化系统（S9混合液）的添加是关键。S9混合液由大鼠肝匀浆超速离心（9000×g，10分钟）得到的上清液（S9组分）与辅助因子（如葡萄糖-6-磷酸、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸）组成，用于模拟体内肝脏代谢。S9混合液的终浓度为10%（v/v），需现用现配（S9组分需-80℃保存，避免酶活性丧失）。

染毒时的细胞密度需适宜：接种细胞时，每培养皿（直径60mm）接种1×10⁵-2×10⁵个细胞，染毒时细胞汇合度达50%-60%，避免细胞过密导致接触抑制（抑制细胞分裂）。

染毒过程需振荡混匀：将样品加入培养基后，轻轻摇晃培养皿（顺时针、逆时针各转3圈），确保样品均匀分布；若为贴壁细胞，染毒后需放回培养箱前轻轻吹打细胞（避免损伤细胞），使样品与细胞充分接触。

纺锤体抑制剂的使用时机与浓度

染色体畸变试验需收集分裂中期的细胞（此时染色体高度浓缩，形态清晰），因此需使用纺锤体抑制剂抑制细胞分裂。常用抑制剂为秋水仙素（Colchicine），其作用机制是结合微管蛋白，阻止纺锤体形成，使细胞停滞在分裂中期。

秋水仙素的加入时机至关重要：需在收获细胞前2-4小时加入（如24小时染毒组，在第20-22小时加入；4小时染毒加20小时恢复组，在第22-24小时加入）。加入过早会导致染色体过度收缩（形态变短变粗），加入过晚则无法收集足够的中期细胞。

秋水仙素的浓度需严格控制：终浓度为0.1-0.2μg/mL。浓度过高会导致染色体收缩过度，难以观察畸变；浓度过低则无法有效抑制纺锤体形成，中期细胞数量不足。例如，CHL细胞对秋水仙素较敏感，浓度超过0.2μg/mL会导致染色体出现“星状”结构，影响观察。

需注意秋水仙素的稳定性：秋水仙素易溶于水，需配制成100μg/mL的储备液，-20℃保存，使用前用培养基稀释至工作浓度。避免反复冻融（超过3次会降低活性）。

细胞收获与低渗固定流程

细胞收获需按固定步骤进行。首先，用胰蛋白酶-EDTA溶液（0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA）消化贴壁细胞：加入1mL胰酶，37℃孵育2-3分钟，待细胞变圆脱落，加入2mL含血清的培养基终止消化，轻轻吹打制成细胞悬液。悬浮细胞（如CHO细胞）直接离心收集（1000×g，5分钟）。

低渗处理是染色体分散的关键：将细胞沉淀重悬于5mL预温（37℃）的0.075M氯化钾（KCl）溶液中，37℃孵育15-20分钟。低渗的原理是通过渗透压差异使细胞吸水膨胀，染色体分散开来。低渗时间需严格控制：时间过短（<15分钟）染色体聚集，难以观察；时间过长（>20分钟）细胞破裂，染色体丢失。

固定需用甲醇-冰醋酸混合液（3:1，v/v），固定3次：第一次固定：加入1mL固定液，轻轻混匀，室温放置10分钟，离心（1000×g，5分钟）；第二次固定：重悬于5mL固定液，室温放置15分钟，离心；第三次固定：重悬于2mL固定液，4℃冰箱放置30分钟（或过夜），使染色体形态稳定。固定液需现用现配（冰醋酸易挥发，甲醇易吸水），避免浓度变化影响固定效果。

固定后的细胞悬液需离心浓缩（1000×g，5分钟），重悬于0.5-1mL固定液中，置于4℃冰箱保存，24小时内制片（放置过久会导致染色体粘连）。

制片与染色的操作细节

制片需使用预冷的载玻片：将载玻片浸泡在冰水中10分钟，取出后立即滴加细胞悬液。滴片时，载玻片与水平面成45°角，从10-15cm高度滴下2-3滴细胞悬液，让悬液自然扩散，然后在空气中晾干（避免阳光直射，防止染色体收缩）。滴片的关键是控制细胞密度：每片约50-100个中期细胞，密度过高（>100个）会重叠，密度过低（<50个）需多次镜检，增加工作量。

染色需用吉姆萨（Giemsa）染液。首先制备染液：将吉姆萨粉末溶于甘油（5g吉姆萨+33mL甘油），56℃水浴2小时使溶解，加入33mL甲醇，过滤后保存于棕色瓶中（储备液）。使用前用磷酸盐缓冲液（PBS，pH6.8）稀释成1%-2%的工作液。

染色步骤：将晾干的载玻片浸入染液中，室温染色10-15分钟。染色时间需根据染液浓度调整：浓度高（2%）染色时间短（10分钟），浓度低（1%）染色时间长（15分钟）。染色后，用流水轻轻冲洗载玻片（避免冲掉染色体），室温晾干。

需注意制片的环境：滴片时需在湿度适宜的环境（湿度≥60%）中进行，避免载玻片过快干燥导致染色体收缩。若环境干燥，可在载玻片周围喷水增加湿度。

镜检的观察要点与计数规则

镜检需使用光学显微镜，配备低倍镜（10×）、高倍镜（40×）和油镜（100×）。首先用低倍镜扫描载玻片，找到中期细胞（圆形或椭圆形，染色体排列成板状）；然后换高倍镜观察染色体形态，若需详细观察畸变，换油镜（需滴加香柏油）。

观察指标包括染色体结构畸变与数目畸变。结构畸变需记录：断裂（染色体上出现无着丝粒的片段）、缺失（染色体末端片段丢失）、易位（非同源染色体间片段交换）、倒位（染色体片段旋转180°）、环状染色体（染色体两端断裂后首尾连接）、双着丝粒染色体（两个着丝粒的染色体）。数目畸变需记录：非整倍体（染色体数目≠2n，如2n+1或2n-1）、多倍体（染色体数目为2n的整数倍，如4n）。

计数规则需遵循国际标准：每个浓度组至少观察200个中期细胞（两个独立实验，共400个细胞）；阴性对照观察200个细胞，阳性对照观察100个细胞。需排除以下细胞：染色体数目异常（如多倍体）超过10%的细胞（可能为融合细胞）、染色体形态模糊（如收缩过度或膨胀）的细胞、重叠无法区分的细胞。

结果判断需计算畸变率：畸变率=（畸变细胞数/观察细胞总数）×100%。阴性对照的畸变率应≤5%（自发畸变率），阳性对照的畸变率应≥10%（显著诱变作用），试验组的畸变率若显著高于阴性对照（P<0.05，卡方检验），则判定为具有诱变活性。