兽药制剂微生物限度检测中控制菌检查的标准操作规程

兽药制剂的微生物质量直接关系到动物用药安全与疗效，其中控制菌检查是微生物限度检测的核心环节之一，旨在排查制剂中可能存在的致病性或指示性微生物。建立科学、规范的标准操作规程（SOP），是保证控制菌检查结果准确性、重复性及合规性的基础，可有效规避检测误差，为兽药质量评价提供可靠依据。

术语与定义

控制菌是指兽药制剂中依据安全性要求不得检出的致病性或指示性微生物，如大肠埃希菌（指示消化道污染）、金黄色葡萄球菌（指示化脓性感染）、沙门菌（指示肠道致病菌）等，其检出结果直接反映制剂的卫生质量。

标准菌株是具有明确生物学特性、遗传稳定性及溯源性的参考菌株，通常来自中国兽医药品监察所（CVRI）或美国典型培养物保藏中心（ATCC），用于方法验证、阳性对照及结果确认。

阳性对照是在供试品处理体系中加入规定量的标准菌株，验证检测方法对控制菌的检出能力；阴性对照则用稀释剂替代供试品，验证试剂、材料及操作过程的无菌性，二者共同保障方法的有效性与可靠性。

这些术语的明确界定是SOP执行的基础，需严格遵循《中国兽药典》（2020版）或相关法规的定义，避免因概念混淆导致操作偏差。

人员与环境要求

检测人员需具备微生物学或相关专业背景，持有兽药检验员资格证，并经《中国兽药典》微生物检测章节、无菌操作技术及控制菌检查专项培训，熟练掌握革兰染色、菌落形态观察等技能。

环境方面，控制菌检查需在B级洁净区（背景环境）内的A级洁净操作台（如超净工作台）进行，洁净区需定期检测悬浮粒子（A级：≥0.5μm粒子≤3520个/m³，≥5μm粒子≤20个/m³）、沉降菌（A级≤1CFU/皿）及表面微生物，确保符合《兽药生产质量管理规范》（GMP）要求。

操作前需对环境进行消毒：用75%乙醇擦拭操作台表面及器具，开启超净工作台风机30分钟以上；无菌服、手套需经高压灭菌，人员进入洁净区需换鞋、更衣、洗手消毒，避免带入外源微生物。

操作过程中需避免人员频繁走动或交谈，禁止在操作台内放置与检测无关的物品，防止交叉污染。

试剂与材料准备

培养基需选用符合《中国兽药典》规定的品种：如大肠埃希菌检查用胆盐乳糖增菌液（BSL）、麦康凯琼脂（MAC）；金黄色葡萄球菌检查用亚碲酸盐肉汤、甘露醇氯化钠琼脂（MSA）；沙门菌检查用四硫磺酸钠煌绿增菌液（TTB）、SS琼脂。

每批培养基需做适用性检查：接种相应标准菌株（如大肠埃希菌ATCC25922），按规定条件培养后，观察菌落形态及生长情况（如大肠埃希菌在MAC上呈圆形、红色、湿润菌落），若生长不良或形态异常，需更换培养基。

标准菌株需保存在-80℃冰箱（冷冻干燥管或甘油菌悬液），传代不超过5次（从冻干管复苏为第1代，每次接种为传1代），避免菌株生物学特性改变；使用前需复苏：将冻干管加入适量无菌生理盐水，溶解后接种于营养琼脂，36℃培养24小时，确认菌落形态正常后使用。

中和剂用于消除供试品的抑菌作用，如供试品含季铵盐类防腐剂，可选用卵磷脂+吐温-80混合液；含青霉素类抗生素，可选用青霉素酶。中和剂需提前验证：将中和剂加入含抑菌成分的供试品中，接种标准菌株，若生长情况与无抑菌供试品一致，说明中和有效。

供试品处理

固体制剂（如散剂、预混剂）：称取10g供试品（精确至0.1g），加入90ml0.9%无菌氯化钠溶液（稀释剂），用均质器混匀（10000r/min，2分钟），制成1:10供试品溶液；若供试品难溶，可加少量吐温-80（如1ml）助溶。

液体制剂（如口服液、注射液）：取10ml供试品，加入90ml稀释剂，摇匀制成1:10溶液；若供试品黏稠，可加热至40℃（不超过45℃）助溶，避免破坏微生物活性。

膏剂（如软膏、乳膏）：称取10g供试品，加入10ml吐温-80（乳化剂），搅匀后加入80ml稀释剂，水浴加热至40℃，边加边搅拌至完全乳化，制成1:10溶液。

若供试品有抑菌作用，需采用以下方法消除：①中和法：加入适量中和剂（如含0.5%卵磷脂的稀释剂）；②稀释法：将供试品稀释至1:100或更高倍数，降低抑菌浓度；③膜过滤法：将供试品溶液通过0.45μm无菌滤膜，用稀释剂冲洗滤膜3次（每次100ml），去除抑菌成分后，将滤膜接种于增菌液。

供试品溶液的pH需调整至6.5-7.5（用1mol/L盐酸或氢氧化钠），避免过酸或过碱影响微生物生长。

控制菌检查方法（以大肠埃希菌为例）

增菌培养：取1:10供试品溶液10ml，加入90ml胆盐乳糖增菌液（BSL），摇匀后置于36℃±1℃恒温培养箱，培养18-24小时。BSL中的胆盐可抑制革兰阳性菌生长，乳糖为大肠埃希菌提供碳源，便于其增殖。

分离培养：用接种环取增菌液1环（约10μl），在麦康凯琼脂（MAC）平板上做划线分离（分区划线，每区划线后灼烧接种环），36℃培养18-24小时。MAC中的胆盐和结晶紫抑制革兰阳性菌，乳糖发酵指示剂（中性红）使发酵乳糖的细菌呈红色。

鉴定试验：挑取MAC平板上的红色可疑菌落（至少2个），做以下试验：①革兰染色：大肠埃希菌为革兰阴性短杆菌；②乳糖发酵试验：将菌落接种于乳糖发酵管，36℃培养24小时，产酸（培养液变黄）产气（杜氏小管有气泡）；③IMViC试验：靛基质试验（阳性，培养液加对二甲氨基苯甲醛后呈红色）、甲基红试验（阳性，培养液变红）、伏-普试验（阴性，培养液不变红）、枸橼酸盐利用试验（阴性，培养基不变蓝），结果为++--。

若需检查其他控制菌（如金黄色葡萄球菌），需调整增菌液与分离培养基：如金黄色葡萄球菌用亚碲酸盐肉汤增菌（亚碲酸盐抑制革兰阴性菌，葡萄球菌还原亚碲酸盐为金属碲，使肉汤变黑），MSA分离（甘露醇发酵产酸，菌落周围呈黄色），鉴定用血浆凝固酶试验（阳性，血浆凝固）。

阳性对照与阴性对照设置

阳性对照：取与供试品处理相同的稀释剂10ml，加入10-100CFU的对应标准菌株（如大肠埃希菌ATCC25922），按供试品检查方法操作，应能检出目标菌（如MAC平板上有红色菌落，IMViC试验++--）。若阳性对照未检出，说明方法无效，需重新验证（如调整中和剂浓度或增菌时间）。

阴性对照：取10ml稀释剂（无供试品），按供试品检查方法操作，所有步骤均应无微生物生长（如增菌液澄清、平板无菌落）。若阴性对照有菌，说明试剂污染或操作不当，需更换试剂并重新检测。

对照试验需与供试品检测同时进行，不可省略，否则检测结果无效。

结果判断与记录

结果判断：①供试品增菌液澄清、分离平板无可疑菌落，或可疑菌落鉴定结果不符合控制菌特征，判为未检出；②供试品增菌液浑浊、分离平板有可疑菌落，且鉴定结果符合控制菌特征，判为检出。

记录内容需包括：供试品名称、批号、规格、生产企业；检测日期、人员；供试品处理方法（如稀释倍数、中和剂种类）；培养基名称、批号；增菌及培养条件（温度、时间）；菌落形态（如红色、圆形、湿润）；鉴定试验结果（如革兰阴性、IMViC++--）；阳性对照与阴性对照结果。

记录需用蓝黑钢笔或签字笔书写，内容真实、完整，不得涂改（如需修改，需在错误处划横线，注明修改人及日期），并由检测人员与复核人员签字确认。

异常结果处理

若供试品检出控制菌，需首先确认阳性对照与阴性对照结果是否正常：若阳性对照检出、阴性对照未检出，说明结果可靠，需通知生产企业召回批次产品，并调查污染原因（如原料带菌、生产过程交叉污染）；若阳性对照未检出或阴性对照有菌，说明检测方法或操作有误，需重新检测。

若供试品结果与预期不符（如原本应未检出的制剂检出控制菌），需重复检测：重新称取供试品，使用新批次培养基与标准菌株，严格按SOP操作；若重复检测结果仍为阳性，需扩大样本量（如检测3个批次），并对生产环境（如车间空气、设备表面）及原料进行微生物检测，查找污染来源。

异常结果需形成书面报告，内容包括：异常情况描述、调查过程、原因分析、处理措施及结论，报检验机构负责人审批后留存。