微生物限度检测中稀释级选择对菌落计数结果的影响研究

微生物限度检测是药品、食品、化妆品等产品质量控制的关键环节，直接关联产品安全性与合规性。稀释级选择作为检测中的核心操作，其合理性直接影响菌落计数的准确性——稀释不足易致菌落重叠无法计数，稀释过高则可能因菌落过少引入大误差。本文结合实验数据与检测实践，系统剖析稀释级选择对计数结果的具体影响，为实验室优化检测流程提供实用参考。

稀释级选择的核心原则

稀释级指样品经无菌稀释液（如生理盐水、磷酸盐缓冲液）倍比稀释后的浓度梯度，常见为10倍系列（10⁰、10⁻¹、10⁻²等）。其选择的核心原则是“让菌落数落在可计数范围”——根据《中国药典》《食品安全国家标准》等要求，平板计数法的可计数范围通常为30-300 CFU/平板。

这一范围的设定基于统计可靠性：菌落数<30时，偶然因素（如接种时的菌损失、个别菌死亡）会放大误差，相对标准偏差（RSD）可能超过25%；菌落数>300时，菌落重叠融合成菌苔，无法区分单个菌落。例如某乳制品初始菌量10⁶ CFU/mL，选10⁻³稀释级（取1mL 10⁻²稀释液加9mL稀释液，再取1mL接种），菌落数约100 CFU，完全符合要求。

实际操作中，需先评估样品菌量：菌量高的样品（如过期食品）选高稀释级（10⁻²、10⁻³），菌量低的样品（如新鲜水果）选低稀释级（10⁰、10⁻¹），确保每个稀释级的菌落数在可计数范围内。

稀释级不足的后果：菌落重叠与结果失真

稀释级不足即稀释倍数过低，导致接种平板的菌量过多。最直接的问题是菌落重叠无法计数，记录为“多不可计”（TNTC），更严重的是掩盖真实菌量，引发误判。

以某熟肉制品为例，实际菌量5×10⁴ CFU/g。若选10⁻¹稀释级（1g样品加9mL稀释液，取1mL接种），平板菌落数超500 CFU，形成密集菌苔；选10⁻²稀释级（取1mL 10⁻¹稀释液加9mL稀释液，取1mL接种），菌落数约50 CFU，结果准确。

更危险的是“假阴性”——某食品限值100 CFU/g，实际菌量120 CFU/g（超标），但因稀释级不足（选10⁰）无法计数，若未调整稀释级重测，可能误判为“合格”。

稀释级过高的风险：误差放大与漏检

稀释级过高即稀释倍数过高，导致接种平板的菌量过少（<30 CFU）。此时少量菌落的增减会直接改变结果数量级，统计误差显著增大。

某爽肤水样品实际菌量80 CFU/mL（符合限值≤100 CFU/mL）。若选10⁻²稀释级（1mL样品加99mL稀释液，取1mL接种），平板菌落数0-1 CFU，计算结果0-100 CFU/mL，无法反映真实值；选10⁻¹稀释级（1mL样品加9mL稀释液，取1mL接种），菌落数约8 CFU，计算得80 CFU/mL，结果可靠。

极端情况是“漏检”——某药品限值50 CFU/g，实际菌量60 CFU/g（超标），若选10⁻²稀释级，平板菌落数0-1，计算结果0-100 CFU/g，可能误判为“合格”。

样品基质抑菌性：稀释级需兼顾“消抑”

部分样品（如含防腐剂的药品、含酒精的化妆品）的基质有抑菌作用，稀释级选择需同时降低抑菌成分浓度。例如某含0.2%山梨酸钾的果酱，实际菌量10⁴ CFU/g，选10⁰稀释级（原液）接种，抑菌成分抑制菌生长，结果仅10² CFU/g；选10⁻³稀释级，山梨酸钾浓度降至0.0002%，菌落数约100 CFU，结果准确。

这类样品需先做“抑菌性试验”：将样品与标准菌株（如金黄色葡萄球菌ATCC 6538）混合，接种不同稀释级平板，观察菌落生长情况，确定能消除抑菌作用的最低稀释级。

操作规范性：稀释级效果的“最后一公里”

即使稀释级选对，操作不规范也会导致结果偏差。常见问题包括：固体样品未充分粉碎、液体样品未混匀、稀释液pH不当。

某固体饮料稀释时，仅手摇10秒，10⁻¹稀释级的两个平板菌落数为45和12（RSD=68%），不符合“同一稀释级两平板差值≤25%”的要求；改用涡旋混合器混匀30秒后，两平板菌落数为42和48（RSD=7%），结果可靠。

稀释液需匹配样品pH：酸性样品用磷酸盐缓冲液，碱性样品用生理盐水，避免pH不当导致菌死亡，影响稀释级效果。

不同检测方法的稀释级调整

不同检测方法对稀释级的要求不同：平板计数法（倾注法）将样品与琼脂混合，菌分布均匀，可计数范围30-300 CFU；涂布法将样品涂在琼脂表面，易重叠，可计数范围20-200 CFU。例如某液体样品实际菌量2×10³ CFU/mL，倾注法选10⁻²稀释级（菌落数约200 CFU），涂布法需选10⁻³稀释级（菌落数约20 CFU）。

膜过滤法（适用于低菌量样品如纯化水）需调整过滤量：纯化水菌量10 CFU/100mL，过滤100mL，菌落数10 CFU；若过滤50mL，菌落数5 CFU，需增加过滤量至200mL，确保菌落数≥20 CFU。

常见误区与规避：从经验到科学

最常见的误区是“经验主义”——长期用固定稀释级检测某类样品，忽略批次变化。例如某面包厂一直用10⁻²稀释级，某批面包因烘烤不足菌量升至10⁵ CFU/g，仍用10⁻²导致菌落数超300，无法计数。

规避方法是“预试验”：检测前取少量样品做2-3个稀释级预培养（如10⁰、10⁻¹、10⁻²），根据预培养菌落数确定正式稀释级。例如预试验中10⁰超300，10⁻¹为80，10⁻²为8，正式检测选10⁻¹。

另一个误区是“忽略平行样差异”——若同一稀释级两平板菌落数差异过大（如45和12），未重新操作直接取平均，结果不准确。正确做法是检查操作规范性，必要时重新稀释接种。