临床前性能验证中参考区间验证的标准化操作流程

参考区间是临床实验室判断检测结果“正常”与否的核心标尺，其准确性直接影响疾病诊断、疗效评估的可靠性。在体外诊断试剂或检测方法的临床前性能验证中，参考区间验证是关键环节——它需通过科学流程确认待验证方法的参考区间是否适配目标人群，或与已建立的标准区间一致。非标准化操作易导致验证结果偏差，甚至误导后续临床应用。因此，构建参考区间验证的标准化操作流程，是保障验证结果科学性、重复性的核心前提。

参考区间验证的核心定义与法规依据

参考区间指从符合特定标准的健康人群中，通过统计方法获得的95%（或其他置信水平）检测结果的分布范围——这是临床判断“异常”的重要依据（如血清肌酐参考区间男性53-106μmol/L、女性44-97μmol/L）。在临床前性能验证中，参考区间验证的本质是“确认待验证方法的检测结果在健康人群中的分布，是否与预期一致”。

法规层面，国际与国内均对参考区间验证提出明确要求。ISO 15189《医学实验室质量和能力要求》规定，实验室需验证参考区间对目标人群的适用性；美国CLIA'88法案要求，若检测系统（如试剂、仪器、校准品）改变，需重新验证参考区间；国内YY/T 1465《体外诊断试剂性能评估通用技术要求》则细化了样本量、统计方法等操作细节，为验证流程提供了具体依据。

这些法规的核心目的一致：确保参考区间“源于健康人群、适用于目标人群”，避免因区间偏差导致临床误判（如将正常结果判定为异常，或遗漏真正的异常结果）。

验证前的准备：样本、人群与处理的标准化

样本量是验证的基础——根据ISO 15189和YY/T 1465，直接建立参考区间需至少120例健康人群样本（若采用分性别、年龄分层，每层需至少120例）；若采用“转移法”（将已有参考区间转移至待验证方法），样本量可减少至20-50例，但需保证方法间相关性良好（相关系数r≥0.95）。样本量不足会导致统计结果不稳定（如小样本的分位数波动大），因此需严格满足最低要求。

人群选择需明确“纳入-排除”标准。纳入标准应匹配目标人群特征：如验证成人血常规参考区间，需纳入18-65岁、无血液系统疾病的人群；验证儿童生长激素参考区间，需按年龄分层（如3-6岁、7-12岁）。排除标准需具体：如近期有感染（影响C反应蛋白）、肝肾功能异常（影响胆红素）、服用干扰药物（如激素影响甲状腺功能）、妊娠（影响绒毛膜促性腺激素）等。需注意，“健康”并非“无任何疾病”，而是“无影响检测指标的疾病”——如验证血糖参考区间，可纳入有高血压但血糖正常的人群。

样本处理需全程标准化。采集环节：需明确采集时间（如皮质醇需清晨8点空腹采集，因昼夜节律影响）、采集部位（如静脉血优先于末梢血）、抗凝剂选择（如电解质检测用肝素锂抗凝，避免EDTA影响钙测定）。处理环节：血清/血浆分离需在采集后1-2小时内完成（避免红细胞内成分渗出）；保存条件需符合试剂要求（如血清促甲状腺激素需2-8℃保存不超过24小时，或-20℃冷冻保存）。任何环节的偏差（如采集时间延迟、抗凝剂错误）都会导致结果异常，影响验证准确性。

验证方法的选择：匹配数据特征与应用场景

参考区间验证的方法需根据数据分布、样本量、方法相关性选择，常见三类：非参数法、参数法、转移法。

非参数法适用于数据分布不明或偏态分布（如肿瘤标志物CA125）。操作步骤：将120例以上健康样本的检测结果排序，取第2.5百分位数（P2.5）和第97.5百分位数（P97.5）作为参考区间。其优点是无需假设数据分布，结果稳健；缺点是需要大样本（≤120例时结果可靠性下降）。

参数法适用于数据呈正态分布（如血常规的红细胞计数、血清白蛋白）。操作步骤：先通过Shapiro-Wilk检验（小样本）或Kolmogorov-Smirnov检验（大样本）确认正态分布，再计算均值（x̄）和标准差（s），参考区间为x̄±1.96s。其优点是统计效率高（小样本即可获得可靠结果）；缺点是对数据分布要求严格——若强行用于偏态数据，会导致参考区间过窄或过宽（如将偏态的血糖数据用参数法，可能遗漏高血糖异常）。

转移法适用于待验证方法与原方法（已建立参考区间）相关性良好的场景（如同一厂家的新试剂替代旧试剂）。操作步骤：用待验证方法检测20-50例健康样本，计算“结果落在原参考区间内的比例”——若比例≥95%，则认为原参考区间可转移至待验证方法。其优点是节省样本量；缺点是依赖方法间的高相关性（r<0.95时不可用），且需确认原参考区间的科学性。

具体操作流程：从数据收集到结果判断

第一步是数据收集：需记录每例样本的完整信息——包括编号、年龄、性别、采集时间、处理过程（如血清分离时间）、检测结果（待验证方法的原始数据）。同时，需标注样本是否符合纳入排除标准（如“样本001：25岁男性，无肝病，采集时间8:00，符合标准”）。

第二步是数据清洗：剔除异常值。异常值指“明显偏离大部分数据的结果”，需结合统计方法与临床信息判断：统计上用Grubbs检验（正态分布）或Dixon检验（非正态分布）识别；临床中需确认样本是否存在采集错误（如溶血）、患者是否有未发现的疾病（如某样本血糖结果异常高，经核查发现患者有隐性糖尿病，需剔除）。需注意：异常值不可随意剔除——需记录剔除原因，确保可追溯。

第三步是统计分析：根据数据分布选择方法。若为正态分布，用参数法计算x̄±1.96s；若为非正态分布，用非参数法计算P2.5和P97.5；若用转移法，计算符合率。例如：验证某血糖试剂的参考区间，120例健康样本结果呈正态分布，均值5.1mmol/L，标准差0.5mmol/L，则参考区间为5.1±1.96×0.5=4.12-6.08mmol/L。

第四步是结果判断：将待验证区间与目标区间（如文献中的标准区间、原方法的区间）比较。若差异在临床可接受范围内（如血糖差异≤0.2mmol/L、肌酐差异≤5μmol/L），则验证通过；若差异超过临床范围（如血糖差异0.5mmol/L），则需查找原因（如样本选择不当、检测方法偏差）。

异常结果的处理：定位原因与解决策略

若验证结果不符合预期（如待验证区间与目标区间差异过大），需按以下流程排查：

首先检查样本质量：确认是否纳入了不符合标准的样本（如将妊娠女性纳入通用人群的促甲状腺激素验证）、样本处理是否错误（如血清分离延迟导致钾离子升高）。例如：某血清钾验证中，参考区间偏高，经核查发现10例样本存在溶血（红细胞内钾释放），剔除后结果恢复正常。

其次检查检测方法：确认仪器是否校准（如校准品过期）、试剂是否稳定（如酶试剂失效）、操作是否规范（如加样量错误）。例如：某肌酐试剂验证中，结果偏低，经检查发现校准品已过期，更换校准品后重新验证通过。

最后检查人群差异：若样本与处理均无问题，需考虑目标人群与原人群的差异（如原参考区间是欧美人群，待验证人群是亚洲人群，可能因种族差异导致结果不同）。此时需重新建立适用于目标人群的参考区间（如增加样本量至200例，采用非参数法计算）。

常见误区规避：从样本到统计的细节把控

误区一：样本量不足。部分验证者为节省成本只用50例样本，导致结果波动大（如P97.5可能从6.0mmol/L波动到6.5mmol/L）。规避方法：严格按ISO 15189要求，至少纳入120例健康样本。

误区二：人群选择模糊。如验证甲状腺功能参考区间时，未排除服用甲状腺激素的患者，导致结果偏高。规避方法：制定详细的纳入排除标准（如“排除近3个月服用甲状腺激素、抗甲状腺药物的人群”），并在采样前通过问卷或检测确认（如检测促甲状腺激素水平）。

误区三：统计方法误用。如对偏态分布的CA125数据用参数法，导致参考区间过窄（如P97.5从35U/mL降到30U/mL）。规避方法：先做正态性检验——若P<0.05（非正态），则用非参数法。

误区四：忽略临床意义。如统计上参考区间差异0.1mmol/L（血糖），但临床无意义，却因“统计差异”判定不通过。规避方法：结合临床需求判断——若差异不影响诊断（如血糖0.1mmol/L不会改变“正常”判断），则可接受。

记录与报告：可追溯性与规范化

验证记录需全程留痕，包括：样本信息表（编号、年龄、性别、采集时间、处理过程、纳入排除状态）、检测结果表（待验证方法结果、原方法结果）、统计分析表（正态性检验结果、分位数/均值标准差）、异常值处理表（剔除样本编号、原因）。记录需用纸质或电子形式保存，保存期限至少与试剂有效期一致（或按实验室规定）。

验证报告需包含以下内容：验证目的（如“验证某血糖试剂的参考区间适用于中国成人”）、验证方法（如“非参数法，120例健康样本”）、样本特征（如“年龄18-65岁，男60例、女60例，无糖尿病”）、统计结果（如“P2.5=4.1mmol/L，P97.5=6.1mmol/L”）、结论（如“验证通过，参考区间为4.1-6.1mmol/L”）。报告需有验证人员签字、审核人员签字、日期，并加盖实验室公章（若用于注册申报）。

规范化的记录与报告不仅满足法规要求，更便于后续追溯——如未来出现临床投诉（如“某患者结果异常但参考区间显示正常”），可通过记录核查样本是否符合标准、统计方法是否正确。