临床前性能验证中干扰试验的阳性对照设置原则与方法

临床前性能验证是体外诊断试剂上市前的关键环节，其中干扰试验旨在评估试剂对临床常见干扰物的抗干扰能力，直接关系到试剂的临床应用可靠性。阳性对照作为干扰试验的“金标准参照物”，其设置的科学性直接影响试验结果的准确性与可重复性。本文结合临床检验实践与监管要求，系统阐述干扰试验阳性对照设置的核心原则，并详解具体方法，为试剂研发与验证人员提供实操指南。

阳性对照设置的相关性原则

干扰试验的核心目标是评估试剂在临床实际应用中的抗干扰能力，因此阳性对照必须选择临床真实存在的干扰物。临床常见干扰物可分为内源性与外源性两类：内源性干扰物多为患者病理状态下产生的代谢产物或生理物质，如黄疸患者的胆红素、溶血性疾病患者的血红蛋白、糖尿病酮症酸中毒患者的β-羟丁酸；外源性干扰物则来自患者摄入的药物、食物或检测过程中的添加剂，如维生素C、肝素抗凝剂、某些抗生素（如头孢曲松）。

若阳性对照选用临床中不存在的干扰物（如超生理浓度的重金属），即使试验显示试剂受干扰，结果也无临床意义。例如某肿瘤标志物试剂曾误选超生理浓度的汞离子作为阳性对照，试验结果虽显示干扰，但因临床无此类情况，最终被监管部门要求重新验证。因此，阳性对照的选择必须紧密结合临床实际场景。

阳性对照设置的代表性原则

阳性对照需覆盖不同类型、不同干扰机制的干扰物，确保试验结果的全面性。临床干扰物的干扰机制各异：胆红素通过吸收检测波长的光产生干扰，血红蛋白通过形成浊度影响光散射，维生素C通过还原反应抑制酶促反应。若仅选择单一机制的干扰物（如仅测胆红素），可能遗漏其他机制的干扰（如血红蛋白）。

某心肌肌钙蛋白I（cTnI）试剂的干扰试验曾因未包含血红蛋白对照，导致临床应用中发现溶血性样本检测结果偏高——血红蛋白通过非特异性结合cTnI抗体，导致检测值虚高。后续补充血红蛋白阳性对照后，才明确试剂的抗干扰缺陷并优化配方。因此，阳性对照需兼顾内源性与外源性、不同病理状态与不同干扰机制的干扰物。

阳性对照设置的浓度合理性原则

阳性对照的干扰物浓度需与临床实际情况一致，即选择“临床显著浓度”——该浓度下的干扰会导致临床诊断错误或治疗决策改变。若浓度过低，可能无法检测出试剂的潜在干扰；若浓度过高（超临床范围），则会导致“假阳性”干扰结果。

浓度确定需基于临床数据：例如收集100例黄疸患者的血清胆红素浓度，计算最大值（如342μmol/L）作为阳性对照浓度；溶血性疾病患者的血红蛋白浓度通常不超过10g/L，因此血红蛋白对照浓度设为10g/L。某甲状腺功能试剂曾将胆红素浓度设为684μmol/L（超临床范围），试验显示干扰，但临床中极少出现该浓度，结果因不合理被要求补充验证。

阳性对照设置的稳定性原则

阳性对照的稳定性直接影响试验结果的重复性。干扰物的化学性质决定了保存条件：胆红素对光敏感，需避光保存（用棕色瓶盛放）；血红蛋白中的亚铁离子易氧化，需-20℃低温保存且避免反复冻融；维生素C易被氧化，需现用现配或冷冻保存。

制备后需验证稳定性：例如将胆红素阳性对照避光保存于4℃，分别在0天、3天、7天测试浓度，若7天内浓度下降超过5%，则需缩短保存时间或调整条件。某血糖试剂的维生素C对照因未现配，放置24小时后浓度下降20%，导致试验结果波动，后续改为临用前溶解才解决问题。

阳性对照设置的可重复性原则

阳性对照需具备良好的均一性与批间一致性，确保不同时间、操作人员的试验结果可重复。制备时需充分混合：将纯品干扰物溶解后添加到正常血清中，用涡旋振荡器混合1分钟以上，确保浓度均匀；若用患者样本，需离心去除细胞碎片，避免颗粒物干扰。

批间一致性验证是关键：制备3批胆红素对照（浓度342μmol/L），测试其对某肝功能试剂的干扰效果，若3批偏差的CV（变异系数）≤5%，说明批间一致。某血脂试剂的对照因混合不充分，批间CV达12%，导致试验结果不可靠，后续优化混合流程（延长涡旋时间至2分钟）后CV降至3%。

干扰物来源的选择方法

阳性对照的干扰物来源分为纯品与临床样本。纯品（如sigma的胆红素标准品）成分单一、浓度可控，适合评估单一干扰物的作用，但需验证溶剂是否干扰——例如胆红素用二甲亚砜溶解，需将溶剂浓度控制在<0.1%（避免影响酶活性）。

临床样本（如黄疸患者血清）更贴近实际，但可能含其他干扰物（如同时含高尿素），需筛选排除：收集黄疸血清后，检测尿素、肌酐浓度，仅选择正常范围的样本。实际应用中常结合两种来源：先用纯品验证单一干扰，再用临床样本验证真实环境下的效果，确保结果全面。

阳性对照品的制备方法

纯品添加法是最常用的制备方式：步骤为“溶解-添加-混合”——用二甲亚砜溶解胆红素纯品（浓度10mg/mL），按比例添加到正常血清中，使胆红素浓度达342μmol/L，涡旋混合1分钟。需验证添加后的浓度准确性（用胆红素试剂测试），确保偏差≤2%。

模拟临床样本法：收集黄疸患者血清，离心去除碎片，检测胆红素浓度（需符合342μmol/L），分装后-20℃保存。需验证样本中无其他干扰物（如用HPLC检测胆红素纯度）。某血脂试剂曾用高胆固醇患者血清作为对照，因未筛选其他代谢物，导致试验结果受尿素干扰，后续通过检测尿素浓度才排除影响。

干扰试验中的平行对照设计

干扰试验需设置平行对照，排除非干扰因素的影响。通常测试三类样本：正常对照（无干扰的血清）、阳性对照（含干扰物的血清）、待验证试剂的测试样本。每个样本需重复测试3次，计算平均值与偏差（偏差=（阳性均值-正常均值）/正常均值×100%）。

结果判断需参考监管要求：例如CLIA'88规定血糖检测的允许偏差为10%，若阳性对照的血糖结果偏差超过10%，说明试剂受干扰。某血糖试剂的维生素C对照（浓度5mg/dL）测试结果偏差达15%，超过允许范围，后续通过添加维生素C氧化酶优化配方，偏差降至5%以下，满足要求。