临床前性能验证中校准曲线的线性回归模型选择与验证

在临床前定量检测方法的性能验证中，校准曲线是建立“已知浓度标准品”与“检测信号（如吸光度、发光值）”间定量关系的核心工具，直接影响待测样本浓度的准确性。线性回归模型作为校准曲线的常用拟合方法，其选择需基于数据的误差特征、方差分布及异常值情况——选择不当可能导致低浓度样本漏检、高浓度样本高估，进而影响药物代谢动力学（PK）、毒理学研究的可靠性。本文结合临床前验证场景，系统探讨线性回归模型的类型、选择逻辑及验证策略，为方法学验证提供可操作指导。

临床前校准曲线的核心作用与线性假设

临床前定量检测（如ELISA、化学发光、LC-MS/MS）的本质，是通过标准品的“浓度-信号”关系推导待测样本浓度。线性假设是指：在一定浓度范围内，检测信号随标准品浓度的增加成正比例变化——这是多数定量方法的底层逻辑，例如ELISA中抗原浓度越高，酶催化产生的吸光度信号越强；化学发光中发光强度与抗原浓度线性相关。

线性假设的成立是定量结果可靠的前提：若信号与浓度无线性关系（如高浓度信号饱和），则无法通过线性模型推导浓度，需改用非线性模型（如四参数逻辑回归）。但临床前验证中，线性方法因操作简单、结果易解释仍是首选——需确认“线性范围”（模型能准确预测的浓度区间），例如FDA指南要求，定量下限（LLOQ）的相对误差（RE）≤±20%，其他浓度≤±15%。

需注意的是，线性范围并非覆盖所有标准品浓度，而是模型能准确预测的区间。例如某LC-MS/MS方法的标准品浓度为0.5、1、5、20、100ng/mL，若100ng/mL时信号饱和（发光值不再随浓度增加），则线性范围需限定为0.5-20ng/mL，剔除100ng/mL后再拟合模型。

常见线性回归模型的类型与适用场景

临床前验证中，线性回归模型的选择需匹配数据特征，常见类型包括普通最小二乘法（OLS）、加权最小二乘法（WLS）、Passing-Bablok回归及Deming回归。

OLS适用于“误差仅来自Y轴（信号测量）”且“方差齐性”的场景——例如用基准物质（纯度>99.5%）直接配制的标准品，浓度误差<1%，信号变异一致（如LC-MS/MS的峰面积方差稳定）。此时OLS通过最小化“信号观测值与预测值的平方和”，能准确拟合“浓度-信号”关系。

WLS适用于“方差不齐”的场景——例如ELISA低浓度点的信号接近空白背景，信噪比低，方差是高浓度的5-10倍（残差图呈“漏斗状”）。WLS通过给低浓度点分配更高权重（如1/方差），降低其预测误差。例如低浓度方差是高浓度的5倍，用“1/方差”作权重后，低浓度RE从30%降至12%。

Passing-Bablok回归是稳健模型，适用于“存在异常值”的场景——例如标准品制备时，某点因移液器漏液导致信号异常偏高（偏离其他点2倍以上）。OLS对异常值敏感，会拉偏回归直线；而Passing-Bablok通过“中位数斜率”计算，可忽略异常值影响，保持模型稳健性。

Deming回归适用于“X轴（标准品浓度）与Y轴均有误差”的场景——例如标准品是稀释系列制备（每步稀释有误差），或浓度由间接定值（如LC-MS/MS校准ELISA标准品）。此时X轴存在误差，Deming通过同时考虑X、Y误差，比OLS更准确。例如血清基质标准品浓度有±10%误差，用Deming回归后，预测偏差从15%降至3%。

模型选择的关键考量因素

模型选择前需回答三个核心问题，构成选择逻辑：

1、误差来源：标准品浓度是否绝对准确？若用基准物质直接配制（误差<1%），选OLS；若为稀释系列或间接定值（误差>5%），选Deming。

2、方差齐性：通过残差图判断——残差随机分布（无趋势）为齐性，选OLS；残差随浓度增大（或减小）为不齐，选WLS。

3、异常值：通过Grubbs检验识别异常值——若为操作误差（如加样错误），剔除后选OLS；若为非操作误差（如标准品变异），选Passing-Bablok。

例如临床前PK研究中，用基准物质配制的标准品（误差<1%）、信号方差稳定，选OLS；用血清基质标准品（误差>10%），选Deming；低浓度方差大，选WLS；存在非操作异常值，选Passing-Bablok。

模型拟合前的数据预处理步骤

数据预处理是模型准确的前提，需完成三步：

信号校正：减去空白信号（如ELISA空白孔吸光度、LC-MS/MS空白基质信号），消除背景干扰。例如ELISA空白孔吸光度0.02，所有标准品信号需减0.02，否则低浓度信号会被高估。

重复测量合并：标准品通常做2-3复孔——无异常值时用平均值（保留更多信息）；有异常值时用中位数（更稳健）。例如某点信号为0.03、0.08、0.05（异常值0.08），用中位数0.05比平均值0.053更准确。

线性范围确定：通过“视觉检查+统计检验”——视觉检查看信号是否饱和（如高浓度信号不再随浓度增加）；统计检验用F检验比较全范围与亚范围的残差平方和，若亚范围残差显著减小（P<0.05），说明全范围非线性，需剔除饱和点。例如标准品浓度1-16ng/mL，16ng/mL信号饱和，剔除后线性范围为1-8ng/mL。

模型拟合后的验证指标与判断标准

模型拟合后需通过三个维度验证准确性，对应临床前验证的核心要求：

残差分析：残差需随机分布（无趋势）且正态（Shapiro-Wilk检验P>0.05）。若残差随浓度增大而减小，说明方差不齐，需改用WLS；若残差非正态，需转换数据（如对数转换）或用稳健回归。

预测误差：计算标准品的RE（(预测浓度-真实浓度)/真实浓度×100%）——LLOQ的RE≤±20%，其他浓度≤±15%（FDA要求）。例如预测0.2ng/mL的浓度为0.22ng/mL，RE=10%，符合要求；若为0.3ng/mL，RE=50%，需调整模型。

一致性检验：验证模型的稳定性——用3个批次标准品拟合模型，计算批间CV（≤10%为稳定）。若CV>15%，说明标准品制备或检测有系统性误差（如试剂批次差异），需优化流程。

临床前验证中的常见问题与解决方案

临床前验证中，模型选择常见问题及解决方法如下：

问题1：低浓度预测误差大——表现为LLOQ的RE>±20%，残差图呈漏斗状。原因是方差不齐。解决方案：改用WLS，权重选1/浓度²或1/方差。例如ELISA低浓度方差是高浓度的5倍，用1/方差作权重后，RE从30%降至12%。

问题2：异常值拉偏模型——表现为某点信号偏离其他点，OLS拟合后预测误差大。解决方案：先排查操作误差（如加样错误），剔除后用OLS；若为非操作误差，用Passing-Bablok。例如某点因仪器故障信号异常，剔除后OLS的R²从0.98升至0.995。

问题3：X轴误差被忽略——表现为模型预测结果与参考方法（如LC-MS/MS）差异大，残差呈系统性偏差。解决方案：改用Deming回归，输入X轴误差（如±5%）。例如ELISA预测血清药物浓度与LC-MS/MS偏差15%，用Deming后偏差降至3%。

案例分析：WLS在ELISA低浓度验证中的应用

某ELISA方法检测药物B的血浆浓度，标准品浓度1、2、4、8、16ng/mL，信号如下：

1ng/mL：10、11、9（平均10，方差0.67）；

2ng/mL：20、21、19（平均20，方差0.67）；

4ng/mL：40、42、38（平均40，方差2.67）；

8ng/mL：75、78、72（平均75，方差6.00）；

16ng/mL：150、155、145（平均150，方差16.67）。

用OLS拟合，方程Y=9.3X+1.2，R²=0.996——预测8ng/mL的浓度为(75-1.2)/9.3≈7.93ng/mL（RE=-0.9%），但预测1ng/mL的浓度为(10-1.2)/9.3≈0.946ng/mL（RE=-5.4%），看似准确，但实际8ng/mL的信号应为80（异常值75），导致模型偏差。

改用Passing-Bablok回归（稳健模型），忽略8ng/mL的异常值，得到方程Y=10X，R²=1.0——预测1ng/mL的浓度为1.0ng/mL（RE=0%），8ng/mL的浓度为8.0ng/mL（RE=0%），准确反映了“浓度-信号”的线性关系。

此案例说明，当存在异常值时，Passing-Bablok比OLS更稳健，能准确拟合线性关系，避免异常值拉偏模型。