传染病检测试剂临床前性能验证的最低检测限验证方案

最低检测限（LOD）是传染病检测试剂临床前性能验证的核心指标之一，直接反映试剂对极低浓度病原体或抗原/抗体的识别能力，是避免漏检、保障检测准确性的关键。本文围绕LOD验证的方案设计，从概念、准备、样本设计、操作、数据处理到结果判定，系统拆解科学验证的全流程，为试剂研发与注册中的LOD评估提供可落地的实操指南。

最低检测限（LOD）的基本概念与验证目的

LOD指检测试剂在规定条件下，对样本中目标分析物（如病毒核酸、细菌抗原、特异性抗体）的最低可稳定检出浓度或量。对传染病检测而言，LOD的本质是“区分阴性与临界阳性样本的边界”——低于此浓度的样本可能因信号太弱被误判为阴性，高于此浓度则需稳定检出。

验证LOD的核心目的有二：一是确认试剂的灵敏度是否符合设计要求（如新冠核酸试剂需检出100 copies/mL以下的病毒）；二是为后续临床研究中的临界值（Cut-off）设定提供数据支撑，确保临床应用中不会遗漏低载量感染样本。

需注意的是，LOD并非“绝对最低值”，而是基于统计概率的结果（通常要求95%的检出率），因此验证过程需严格遵循统计学原则，避免主观判断干扰。

验证前的试剂与材料准备

试剂一致性是LOD验证的基础。需选择同一批次、在有效期内且稳定性良好的试剂（如ELISA试剂盒需确认酶结合物未失效，PCR试剂需确认引物探针未降解），并提前完成批内均一性验证（如随机抽取10支试剂检测同一样本，CV值≤10%）。

参考物质的选择需满足溯源性要求：优先使用有证参考物质（CRM），如WHO的新冠病毒RNA参考品；若无CRM，可使用经过标定的实验室自制参考物质（如用假病毒颗粒或重组抗原制备），需记录标定方法（如数字PCR定量）。

实验器材需提前校准：移液器需用电子天平验证加样准确性（如10μL移液器的实际加样量误差≤±0.5μL）；PCR仪需用温度验证片确认孔间温差≤0.5℃；ELISA酶标仪需用校准板验证吸光度准确性。

LOD验证的样本设计要点

样本浓度梯度需覆盖预期LOD的“临界区间”。通常设置5-6个浓度点：从预期LOD的0.5倍到2倍（如预期LOD为50 copies/mL，可设置25、50、75、100 copies/mL），每个浓度点需做至少20次重复测试（满足统计学要求）。

基质匹配是关键。样本基质需与临床实际使用的样本一致（如检测血清抗体则用血清基质，检测鼻咽拭子核酸则用拭子保存液基质），避免因基质效应（如血清中的蛋白干扰）导致LOD偏高。

阴性对照需同步设置：每批实验需加入至少10份阴性样本（如无目标分析物的健康人血清），用于验证假阳性率（需≤5%），确保LOD结果不受非特异性反应影响。

实验操作的标准化流程

操作一致性需贯穿全程。加样时需固定加样顺序（如从低浓度到高浓度，避免交叉污染），使用同一品牌吸头并确保吸头与移液器匹配；孵育步骤需严格控制温度与时间（如ELISA的37℃孵育需用恒温箱而非室温，时间误差≤1分钟）。

洗涤步骤需规范：如ELISA洗板时，洗板机的压力需设置为200-300 mbar，每孔注液量≥300μL，洗涤次数≥5次，最后拍板需用干净滤纸轻拍（避免孔内残留液体）。

读数与记录需及时：ELISA终止反应后需在10分钟内读数，PCR扩增完成后需立即导出荧光曲线；所有操作步骤需详细记录（如加样时间、孵育温度、洗板次数），便于后续追溯误差来源。

数据处理的统计方法选择

数据处理需遵循CLSI EP17-A2指南（临床实验室方法检测限和定量限验证）。首先计算每个浓度点的阳性检出率（阳性数/重复次数×100%），然后找到“检出率≥95%的最低浓度”作为候选LOD。

异常值处理需谨慎：若某一重复测试结果与同浓度点其他结果差异显著（如ELISA吸光度比均值低50%），需先核查操作记录（如是否漏加试剂），确认是操作误差后可剔除；若无法确认，需保留数据并在报告中说明。

统计工具可选择Excel或SPSS：用Excel的binom.dist函数计算某浓度点达到95%检出率的概率，或用SPSS做卡方检验，确认不同浓度点的检出率差异有统计学意义（P<0.05）。

结果判定的关键原则

核心判定标准：候选LOD需满足“检出率≥95%且阴性样本假阳性率≤5%”。例如，50 copies/mL浓度点20次重复中19次阳性（95%），25 copies/mL仅15次阳性（75%），则LOD为50 copies/mL。

若某浓度点检出率在80%-95%之间（如18次阳性），需增加重复次数至30次：若仍≥95%，则纳入候选；若<95%，则剔除。

需对比验证结果与预期LOD：若验证LOD高于预期（如预期50 copies/mL，实际75 copies/mL），需回溯问题（如试剂灵敏度不足或操作误差），调整后重新验证。

验证过程中的常见问题与规避策略

基质效应干扰：若用缓冲液配制的参考物质验证LOD为50 copies/mL，但血清基质中仅能检出75 copies/mL，需优化试剂（如加入基质增强剂）或调整参考物质基质（用血清稀释参考品）。

操作误差：新手操作易出现加样量偏差，需提前完成操作培训（如练习加样10次，确保误差≤±1μL），并由同一操作人员完成全部实验。

设备波动：PCR仪孔间温差过大可能导致边缘孔检出率低，需提前用温度验证片测试，将样本放在中间孔（温差≤0.5℃的区域），或更换校准后的仪器。

试剂稳定性：若验证周期超过1周，需每天检测同一份质控品（如已知浓度的阳性样本），确保试剂性能无下降（质控品检出率需100%）。