生物相容性检测中细胞毒性测试的MTT法操作要点

生物相容性是医用材料临床转化的核心门槛，细胞毒性测试作为其基础评价项目，直接反映材料对细胞存活、增殖的影响。MTT法因操作简便、灵敏度高、重复性好，成为细胞毒性测试的经典技术，但实验结果易受操作细节干扰。本文结合ISO 10993-5标准与实践经验，拆解MTT法从试剂准备到结果检测的关键操作要点，帮助实验人员规避误差，获得可靠数据。

MTT试剂的准备与存储

MTT（3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴盐）是实验核心试剂，其纯度与稳定性直接决定结果准确性。配置时需用无血清PBS（pH7.2-7.4）溶解，浓度为5mg/ml，磁力搅拌30分钟确保完全溶解；溶解后用0.22μm滤膜过滤除菌，避免细菌污染细胞。

过滤后的MTT溶液需分装为1ml/支的小剂量，密封后4℃避光保存（可稳定1个月）。若溶液从黄色变为深绿或紫色，说明已氧化降解，需立即丢弃。需注意，MTT不可反复冻融——多次冻融会破坏分子结构，降低还原能力，因此应按需分装，用后剩余部分仍放回4℃冰箱。

细胞株的选择与复苏规范

细胞株优先选L929小鼠成纤维细胞（ISO 10993-5推荐），其对毒性敏感、形态稳定，能准确反映材料的细胞毒性。细胞复苏需“快速解冻、缓慢复温”：从液氮罐取出冻存管，立即放入37℃水浴1-2分钟至冰晶融化，再用5倍体积预热培养基稀释，1000rpm离心5分钟，弃上清后用新鲜培养基重悬接种。

复苏后需观察细胞形态：正常L929呈梭形、贴壁生长，若出现圆形漂浮细胞，说明复苏失败。细胞传代次数需控制在10代内——传代过多会导致细胞代谢能力下降，影响毒性敏感性。实验前用台盼蓝染色计数，活细胞率需≥90%，否则需重新复苏。

受试样品的处理规范

受试样品需制备“浸提液”模拟体内溶出行为：固体材料切割为1cm×1cm小块，75%乙醇消毒30分钟后用PBS冲洗3次；浸提比例为“材料表面积:浸提液体积=1:1（cm²/ml）”，浸提液选含10%胎牛血清的DMEM培养基（模拟体内蛋白质环境）。

浸提条件为37℃静态孵育24小时，避免振荡（振荡会加速杂质释放，高估毒性）。浸提结束后用0.22μm滤膜过滤，去除细菌或颗粒，4℃保存并在24小时内使用。液体样品需用培养基梯度稀释（如10%、20%、50%、100%），确保渗透压≤320mOsm/kg，避免高渗损伤细胞。

细胞接种的密度控制

96孔板接种密度需控制在每孔1×10⁴-2×10⁴个细胞（体积100μl）——密度过低会导致MTT还原量不足，过高则细胞拥挤、代谢废物积累，均影响结果。接种前需充分混匀细胞悬液，避免沉淀；用多道移液器确保每孔体积一致（误差≤5μl），减少“边缘效应”（边缘孔细胞密度高于中心孔）。

接种后需静置2-4小时让细胞贴壁，再加入受试样品——若直接加样会影响细胞贴壁，导致结果偏差。“边缘效应”可通过“边缘孔加PBS”解决：边缘孔加入等体积PBS，而非培养基，减少温度波动导致的培养基蒸发。

药物暴露的时间与浓度设置

药物暴露时间依毒性类型选择：急性毒性选24小时，慢性毒性选48-72小时。浓度需设5-6个梯度（如0.1mg/ml、0.5mg/ml、1mg/ml、2mg/ml、5mg/ml），覆盖从无毒性到完全毒性的范围——最低浓度需保证细胞存活率≥80%，最高浓度≤20%，便于绘制剂量-反应曲线。

暴露前需确认细胞贴壁（接种2-4小时后），加样时轻轻滴加至孔底，避免冲起细胞；每个浓度设3个复孔，减少误差（复孔吸光度差值需≤0.1）。同时设置阴性对照（正常细胞+培养基）和阳性对照（正常细胞+0.1% Triton X-100）：阴性对照为存活率基准，阳性对照需确保细胞存活率≤10%，验证实验体系有效性。

MTT溶液的添加与孵育

MTT溶液需在药物暴露结束前4小时添加——此时细胞处于对数生长期，线粒体脱氢酶活性最高，MTT还原量与活细胞数相关性最好。96孔板每孔加20μl 5mg/ml MTT溶液（终浓度0.5mg/ml），添加时用“慢吸慢放”模式，避免产生气泡（气泡会阻碍MTT与细胞接触）。

孵育条件为5% CO₂、37℃，严格控制4小时——孵育过久会导致结晶过度沉淀，过短则结晶量不足。若使用含酚红的培养基，需在加MTT前吸出部分培养基（保留50μl），减少酚红与MTT的反应干扰。

结晶溶解的操作技巧

孵育结束后，需吸出孔内培养基（避免吸走甲瓒结晶），每孔加150μl DMSO（二甲基亚砜）溶解结晶。将培养板置于振荡器上振荡10-15分钟（转速100rpm），确保结晶完全溶解——若显微镜下仍有颗粒，可37℃孵育5分钟后再振荡5分钟，不可加热过久（DMSO会破坏甲瓒结构）。

溶解后需用密封膜覆盖培养板，避免DMSO挥发（DMSO挥发性强，会导致溶液浓度变化）。若偏好其他溶解剂，可选用“酸化异丙醇”（0.04M HCl的异丙醇溶液），但需更快检测（异丙醇挥发更快）。

吸光度检测的注意事项

吸光度检测用酶标仪，波长选570nm（甲瓒最大吸收峰），参考波长630nm（校正背景吸收，如酚红、DMSO杂质）。检测前需用空白孔（培养基+MTT+DMSO，无细胞）校准零点，确保准确性。

溶解后的溶液需在30分钟内检测完毕——DMSO中的甲瓒会逐渐氧化，每10分钟吸光度下降约5%。检测前需刺破孔内气泡（气泡会散射光线，导致吸光度偏高），每孔检测3次取平均，减少随机误差。空白孔吸光度需≤0.1，否则需更换MTT或DMSO。

背景干扰的排除方法

背景干扰主要来自试剂污染、细胞污染或样品颜色：①试剂污染：MTT需分装保存，DMSO用分析纯并过滤；②细胞污染：实验前超净台紫外消毒30分钟，操作在酒精灯旁进行，定期检测培养箱环境；③样品颜色：若浸提液呈红/黄色，需设“样品空白孔”（样品+培养基+MTT+DMSO，无细胞），用实验孔OD减去样品空白孔OD，扣除颜色干扰。

若样品颜色过深（吸光度>0.5），需稀释后再实验，或改用CCK-8法（对颜色干扰更不敏感）。实验后需统计边缘孔与中心孔的吸光度差值，若差值>0.2，需排除边缘孔数据，重新计算。