生物相容性检测中细胞毒性测试的操作流程详解

细胞毒性测试是生物相容性检测的核心环节，旨在评估医疗器械、生物材料或药物制剂对细胞生长、代谢及形态的影响，是判断材料是否适用于体内应用的关键依据。本文从试验准备、材料处理、细胞培养、浸提液制备到毒性评价的全流程展开，详细解析细胞毒性测试的标准操作步骤，为试验人员提供实操指南。

试验前的准备工作

试验前需完成试剂、仪器及无菌环境的准备。试剂方面，提前配制或采购适宜的细胞培养基（如DMEM、RPMI-1640），添加10%-15%胎牛血清（FBS）提供营养，同时准备胰蛋白酶（细胞传代用）、MTT试剂（细胞存活率检测用）等。仪器需校准：CO₂培养箱确认温度（37℃±0.5℃）、CO₂浓度（5%±0.5%）稳定；超净工作台用75%乙醇擦拭后开紫外线照射30分钟灭菌；酶标仪预热并验证波长准确性。操作人员需穿无菌服、戴手套口罩，避免污染。

无菌操作是基础。与细胞接触的耗材（培养瓶、96孔板、枪头）需高压灭菌或用一次性无菌品；试剂瓶开启后用酒精棉擦瓶口；玻璃器皿经酸洗、冲洗后高温灭菌，确保无残留杂质影响细胞生长。

受试材料的处理

受试材料需规格标准化。按试验要求切割成统一尺寸（如1cm×1cm片状）或称量固定质量（如1g/份），保证每批样品表面积或质量一致，确保浸提液浓度均一。灭菌方式依材料性质选：耐高温的金属、玻璃用121℃高压蒸汽灭菌20分钟；不耐高温的高分子材料（聚乙烯、聚乳酸）用环氧乙烷灭菌（37℃-55℃，4-6小时）；易氧化材料选过滤灭菌。

灭菌后需验证无菌性：取少量材料接种肉汤培养基，37℃孵育48小时，培养基澄清则无菌。同时检查材料完整性，如高分子材料是否变形、金属是否生锈，损坏需更换。

细胞系的选择与培养

细胞系选契合材料应用场景的：L929小鼠成纤维细胞适用于多数植入材料（对毒性敏感、易培养）；Hela细胞用于黏膜接触材料；MC3T3-E1成骨细胞用于骨植入材料。选细胞系需考虑靶器官相关性，如心脏支架用心肌细胞系、皮肤敷料用角质形成细胞系。

细胞培养按生长条件来：L929细胞用高糖DMEM+10%FBS+1%双抗，置5%CO₂培养箱。每日观察形态：正常细胞梭形、贴壁，汇合度80%左右传代。传代时用胰酶消化2-3分钟，加血清终止，吹打为悬液后1:3-1:5接种新瓶。

细胞活性需验证：台盼蓝染色计数，活细胞率≥90%方可使用。活性不足则复苏冻存株或调整培养条件（换血清、调CO₂浓度）。

样品浸提液的制备

浸提液制备按ISO 10993-12标准。选浸提介质：水溶性材料用生理盐水或无血清培养基；疏水性材料（橡胶、塑料）用含10%FBS的培养基（血清蛋白促进疏水毒性成分溶出）。浸提比例：固体材料用表面积体积比（1cm²/ml），粉末用质量体积比（1g/ml），保证材料与介质充分接触。

浸提条件模拟体内：材料与介质密封后37℃孵育24小时（或延长至72小时），期间摇晃1-2次促毒性成分释放。浸提后用0.22μm滤膜过滤除菌，4℃保存24小时内用。需设空白对照（未加材料的浸提介质），排除介质本身影响。

细胞接种与暴露

用96孔板接种细胞：将对数期细胞消化成悬液，稀释至1×10⁴-5×10⁴ cells/ml，每孔加100μl，确保每孔细胞数一致（误差≤10%）。接种后37℃孵育24小时，让细胞贴壁（贴壁细胞需完全附着孔底形成单层）。

暴露时吸出旧培养基，每孔加100μl浸提液（试验组）或空白对照液（对照组），设3-5个平行孔减误差。暴露时间依目的选：短期24小时测急性毒性，长期48-72小时评慢性毒性。暴露中每日观察，若孔内浑浊（污染）则剔除数据。

注意浸提液体积一致：浓缩液需稀释至工作浓度，保证每孔100μl；液体样品稀释后需保证血清浓度≥10%，避免影响细胞生长。

毒性效应的评价方法

毒性评价需结合多种方法。形态学观察最直观：倒置显微镜看细胞形态，正常细胞贴壁紧密、形态规则（L929呈梭形）；毒性下细胞皱缩、变圆、脱落，或有空泡、凋亡小体，记录变化并拍照片。

MTT法是细胞存活率金标准：暴露结束后每孔加20μl MTT（5mg/ml），孵育4小时（活细胞线粒体脱氢酶还原MTT为蓝紫色甲瓒）。吸去液体加150μl DMSO溶解甲瓒，酶标仪测490nm OD值。细胞存活率=（试验组OD/对照组OD）×100%，≥80%无毒性，<40%重度毒性。

LDH释放法测细胞膜损伤：收集培养液上清，加LDH检测试剂孵育30分钟，测450nm OD值。LDH释放率=（试验组OD-空白OD）/（最大释放组OD-空白OD）×100%，释放率越高损伤越重（最大释放组用0.1%Triton X-100破膜）。

试验数据的记录与分析

数据需及时准确记录：试验日期、操作人员、细胞系批号、材料规格、浸提条件、细胞浓度、暴露时间、OD值、形态学结果。记录用纸质或电子表，确保可追溯。

数据处理：先算平行孔平均值和标准差（SD），异常值（与均值差超2倍SD）剔除。再算存活率或释放率，与对照组比，用t检验看差异是否显著（P<0.05）。若试验组存活率显著低，说明材料有毒性。

试验需重复：同一批样品至少做3次独立试验，结果一致才有效。若结果差异大，检查变量（细胞批次、浸提条件、仪器稳定性），找原因修正。