井水水样检测中总大肠菌群的检测方法及结果判定

总大肠菌群是井水饮用水微生物安全的核心指示菌，其存在提示水样可能受粪便污染，隐含肠道致病菌风险。准确的检测方法与规范的结果判定，是保障井水饮用安全的关键技术环节。本文依据《生活饮用水标准检验方法 微生物指标》（GB/T 5750.12-2006）等国家规范，详细解析井水水样中总大肠菌群的检测流程、操作要点及结果判定规则。

井水水样的采集与保存要求

井水水样的采集直接影响检测准确性。采样前需准备灭菌聚乙烯瓶（121℃高压灭菌15分钟），避免容器污染。采样点选在井水水面下0.5米处，避开底部沉积物与井口杂物；若用水泵，需放水5分钟后采集出口水。

采样量需≥500ml，确保后续操作有足够样本。采样后立即密封，置于4℃以下冷藏（如冰袋），保存时间不超过24小时——超过时间会导致菌群数量变化，需重新采样。

注意：采样时禁止手触容器内壁或水样，若井水浑浊/异味，需在记录中注明，便于后续分析干扰因素。

总大肠菌群检测的基础原理

总大肠菌群是能在37℃发酵乳糖、产酸产气的革兰氏阴性无芽孢杆菌，主要来自粪便。检测方法基于其生物学特性：通过特定培养基诱导发酵乳糖，或利用β-半乳糖苷酶分解底物，实现定性/定量检测。

例如，多管发酵法用乳糖蛋白胨培养基，若有总大肠菌群，会分解乳糖产酸（培养基变黄）产气（倒管集气）；滤膜法通过过滤截留细菌，在选择性培养基上形成特征菌落；酶底物法检测β-半乳糖苷酶活性（变黄/荧光），直接判断是否存在。

理解原理可识别异常：若培养基未产酸但产气，可能是其他产气菌干扰，需进一步确认。

多管发酵法的操作步骤与要点

多管发酵法适用于各种污染程度的井水，分初发酵、复发酵、确认三阶段。首先稀释水样：取10ml水样加90ml生理盐水（10⁻¹稀释），再取10ml稀释液加90ml生理盐水（10⁻²稀释），一般做3个稀释度。

初发酵：取不同稀释度水样10ml（或1ml、0.1ml），接种3支乳糖蛋白胨发酵管，37℃培养24小时。若培养基浑浊、变黄且倒管有气体，为初发酵阳性。

复发酵：将阳性管取1环培养液，接种到伊红美蓝琼脂（EMB）平板，37℃培养18-24小时。总大肠菌群会形成紫黑色、带金属光泽的菌落（直径1-2mm）。

确认：挑取特征菌落做革兰氏染色——若为阴性无芽孢短杆菌，确认是总大肠菌群。要点：稀释倍数需匹配污染程度，清洁井水可直接接种10ml，污染重需更高稀释（如10⁻³）。

滤膜法的操作流程与注意事项

滤膜法适用于清洁井水（菌落少），可定量检测。需准备0.45μm混合纤维素酯膜（121℃灭菌15分钟）、过滤装置。

流程：组装过滤装置，用生理盐水冲滤膜2-3次；取100ml水样倒入过滤杯，开真空泵（压力≤0.05MPa），使水样完全通过；用镊子取滤膜，菌面朝上贴EMB平板（无气泡）。

培养计数：37℃培养24小时，计数紫黑色带金属光泽的菌落。结果=菌落数×稀释倍数（未稀释直接计数）。若悬浮物多，需先离心（3000rpm 5分钟）或滤纸过滤，避免滤膜堵塞。

注意：若菌落数>100，需稀释后重测；<10则增加采样量（如过滤200ml）。

酶底物法的应用特点与操作细节

酶底物法快速简便，无需稀释/过滤，适用于批量检测。核心试剂含ONPG（产黄）和MUG（产荧光），利用β-半乳糖苷酶分解底物。

操作：取100ml水样加酶底物培养基，混匀倒入反应瓶，37℃培养24小时。若变黄或有荧光（366nm紫外灯），为阳性；均无则阴性。

特点：24小时出结果，但成本高，无法区分菌落形态。适用于应急检测。细节：若水样含余氯，需加0.1ml 10%硫代硫酸钠中和，避免抑制酶活性。

总大肠菌群结果判定的核心依据

结果判定需遵循标准，不同方法标准不同：

1、多管发酵法：根据初发酵阳性管数，查MPN表得结果（如3个稀释度阳性管数为3、2、1，查得110 MPN/100ml）。

2、滤膜法：计数EMB平板特征菌落，菌落数10-100最准确；>100需稀释重测；<10增加采样量。结果=菌落数×稀释倍数。

3、酶底物法：阳性表示存在总大肠菌群，定量查MPN表（如5管法），定性报告“阳性/阴性”。

注意：结果需注明方法，如“总大肠菌群：未检出（滤膜法）”，确保可追溯。

检测过程中的质量控制要点

质量控制贯穿全程：

1、空白对照：用灭菌生理盐水代替水样，若阳性，说明试剂/器皿/环境污染，需重测。

2、阳性对照：用大肠杆菌ATCC25922接种，若未阳性，说明培养基失效或操作错，需更换培养基。

3、平行试验：同一样品做2份平行，结果偏差≤10%（如滤膜法），否则重测。

4、人员与环境：检测人员需培训，实验室定期紫外线消毒（30分钟/天），避免交叉污染。

常见干扰因素及处理方法

假阳性（未污染却阳性）：原因包括采样容器未灭菌、培养基灭菌不彻底、操作污染。处理：重新采样，检查培养基灭菌，严格无菌操作。

假阴性（污染却阴性）：原因包括水样保存不当（温度高致菌群死亡）、培养基失效（乳糖过期）、余氯未中和（抑制酶活性）。处理：重新采样，换有效期内培养基，加硫代硫酸钠中和余氯。

菌落异常：若EMB平板出现非紫黑色菌落，需做革兰氏染色和乳糖发酵试验，确认是否为总大肠菌群；若为革兰氏阳性，排除杂菌。

例如，初发酵阳性但复发酵无特征菌落，可能是初发酵管气体来自非乳糖发酵菌，需重新复发酵。