海水水样检测中叶绿素a的高效液相色谱检测方法

叶绿素a是海水浮游植物生物量的核心指示指标，直接反映水体富营养化程度与生态平衡状态，其准确检测对海洋环境监测、赤潮预警及渔业资源评估至关重要。高效液相色谱（HPLC）因分离效率高、定性定量精准，已成为海水叶绿素a检测的主流技术。本文从样品采集、提取净化到仪器分析，系统拆解HPLC检测的关键环节与优化策略。

海水叶绿素a样品的采集与预处理

海水样品需用棕色玻璃采样瓶采集，避免光照降解叶绿素a，采样深度根据监测需求选择（如表层0.5m或分层采样）。采集后立即放入4℃保温箱，24小时内完成预处理。预处理核心是分离浮游植物与水体：用提前450℃灼烧4小时的GF/F玻璃纤维滤膜（孔径0.7μm）过滤，抽滤压力≤0.05MPa，防止细胞破裂；滤膜截留浮游植物后，装入铝箔袋-20℃冷冻保存，避免反复冻融。

若水样悬浮物过多，可先3000rpm离心5分钟去除大颗粒，再过滤。冷冻滤膜需在弱光下解冻，避免叶绿素a光解；保存时间不超过1个月，否则会因细胞自溶导致检测值偏低。

叶绿素a的提取液选择与提取方法

提取液需兼顾溶解度与稳定性，常用90%丙酮（丙酮:水=9:1）、100%甲醇或乙腈-甲醇（1:1）混合液。90%丙酮对叶绿素a溶解度最高，且对叶绿素b、类胡萝卜素的干扰小，是行业首选；甲醇提取效率快，但易引入甲醇溶性杂质；乙腈混合液可直接进样HPLC，无需溶剂转换。

提取方法以超声提取或黑暗浸泡为主：超声提取时，滤膜剪碎加5mL提取液与无水硫酸钠（除水），冰浴200W超声10分钟，4℃黑暗放置1小时后10000rpm离心10分钟取上清；黑暗浸泡则是滤膜浸提取液，4℃黑暗放置24小时，期间摇匀2次，再离心。研磨法虽高效，但操作繁琐易引入杂质，适合少量样品。

提取全程弱光操作，离心管裹锡箔纸；提取液现用现配，避免挥发浓度变化；无水硫酸钠需提前105℃烘干，去除水分。

提取液的净化与除杂

海水提取液含腐殖质、蛋白质等杂质，会污染色谱柱或干扰分离，需净化。基础净化是离心-过滤：提取液10000rpm离心10分钟，上清过0.22μm有机相滤膜（尼龙或PTFE），去除微米级颗粒。

腐殖质含量高时用固相萃取（SPE）：C18小柱（500mg/6mL）用5mL甲醇活化、5mL水平衡，提取液以1mL/min流速上样，5mL水冲洗水溶性杂质，5mL乙腈-甲醇（8:2）洗脱叶绿素a。SPE可有效去除腐殖质与干扰色素，提高峰分离度。

净化后液体4℃保存不超过24小时；滤膜需用提取液浸泡30分钟，去除残留溶剂；SPE小柱一次性使用，避免交叉污染。

HPLC分析条件的优化

色谱柱选C18反相柱（如Agilent Zorbax SB-C18，250×4.6mm，5μm），非极性固定相可分离叶绿素a与脱镁叶绿素a等杂质；柱温30℃，减少流动相黏度提高效率。

流动相常用乙腈-水-乙酸（85:14.5:0.5）或甲醇-乙腈-水（60:30:10）。乙腈体系的叶绿素a保留时间稳定（8-10分钟），峰形对称；加0.5%乙酸抑制解离，避免峰拖尾。流动相需超声脱气15分钟，防止气泡导致柱压升高或基线漂移。

检测用UV-Vis检测器，波长440nm（叶绿素a最大吸收峰）；流速1.0mL/min，进样量10μL；低浓度样品可增至20μL或梯度洗脱（80%乙腈10分钟升至100%），提高灵敏度。

叶绿素a的定性与定量分析

定性靠保留时间与光谱：标准品（如GBW08609）保留时间8.5分钟，样品峰偏差≤0.2分钟，且440nm有特征吸收，即为叶绿素a。脱镁叶绿素a干扰时，对比光谱：脱镁叶绿素a在410nm有额外吸收峰。

定量用外标法：配制0.1-10.0μg/mL标准液，进样得峰面积，绘线性回归曲线（R²≥0.999）。样品浓度C=(峰面积-截距)/斜率×稀释倍数（提取液体积/水样体积，如5mL/1L=5）。

标准液需用提取液配制，避免溶剂误差；标准曲线每批样品重绘，确保准确性。

检测过程的质量控制要点

空白试验：提取液代替水样，空白峰面积≤样品5%，无污染。平行样：每10样加1平行，RSD≤5%，否则重测。

加标回收率：取已知浓度样品加0.5-2倍标准液，回收率85%-110%。偏低查提取/净化损失，偏高查污染（提取液、容器）。

定期用有证标准物质验证仪器：标准值偏差≤5%，仪器状态好。色谱柱每周用甲醇0.5mL/min冲洗30分钟，去除残留杂质，延长寿命。