矿泉水水样检测中微生物限度检查的操作流程及标准

矿泉水作为直接饮用的包装饮用水，其微生物安全性是保障消费者健康的核心指标。微生物限度检查通过量化细菌、霉菌等微生物数量，判断矿泉水是否符合卫生标准，操作流程的规范性与标准的严格性直接影响结果准确性。本文围绕矿泉水水样微生物限度检查的全流程，详细梳理操作要点与判定标准，为检测实践提供专业参考。

操作前的环境与设备准备

微生物限度检查需在无菌环境中进行，实验室应设置万级洁净区（ISO 14644-1 Class 10000），局部操作区（如超净工作台）需达到百级（Class 100）。操作前30分钟开启超净工作台风机，用紫外灯消毒30分钟，随后关闭紫外灯，用75%乙醇擦拭台面、移液器及镊子等工具，确保无灰尘或微生物残留。

人员需穿着无菌连体服、帽子、口罩及手套，手部用75%乙醇消毒两次（每次1分钟），避免皮肤直接接触样品。培养箱需提前预热至设定温度（细菌36℃±1℃、霉菌25℃±1℃），高压灭菌锅需验证灭菌效果（121℃、15分钟），确保培养基、试剂无菌。

样品的采集与预处理

采样容器需使用经121℃高压灭菌20分钟的无菌聚乙烯瓶（容量≥250mL）。采样时，去除容器外标签，用乙醇擦拭瓶口，打开瓶盖后避免接触瓶口内壁，直接接取200mL水样（占容器容积80%），立即盖紧瓶盖，防止空气微生物污染。

样品需在4℃±2℃冷藏保存，24小时内完成检测。检测前需稀释：取10mL水样加入90mL无菌生理盐水（1:10稀释），用漩涡混合器振荡30秒混匀；如需更高稀释度（如1:100），则取10mL 1:10稀释液加入90mL生理盐水，依次类推。稀释过程需在超净工作台内进行，每一步均需更换无菌移液器头。

培养基与试剂的制备验证

常用培养基包括：营养琼脂（细菌总数）、孟加拉红琼脂（霉菌酵母菌）、乳糖胆盐发酵液（大肠菌群）。培养基需按说明书配制，调整pH至规定范围（如营养琼脂pH 7.2±0.2），分装后121℃灭菌15分钟，冷却至45℃±5℃备用。

培养基需做两项验证：一是无菌检查——取10mL培养基倒平板，36℃培养48小时无菌落；二是促生长试验——接种标准菌株（如细菌用金黄色葡萄球菌ATCC 6538，霉菌用黑曲霉ATCC 16404），培养后菌落形态正常、生长良好为合格。试剂如无菌生理盐水，需灭菌后4℃保存，使用前恢复至室温。

接种与培养的操作规范

细菌总数用倾注法：取1mL不同稀释度水样（原水、1:10、1:100）加入平板，倒入15mL 45℃营养琼脂，旋转混匀后凝固，倒置平板36℃培养48小时。每个稀释度做2个平行板，确保结果重复性。

霉菌酵母菌用涂布法：取0.1mL稀释液均匀涂布于孟加拉红平板（L型玻璃棒旋转涂布），正置平板25℃培养72小时。涂布法可避免霉菌孢子因倾注法被埋入培养基，提高计数准确性。

大肠菌群用多管发酵法：取10mL原水加双料乳糖胆盐发酵液（3管）、1mL原水加单料发酵液（3管）、1mL 1:10稀释液加单料发酵液（3管），36℃培养24小时，观察产酸产气情况（变黄、导管有气泡）。

菌落计数的方法与要求

培养后，在自然光下计数：细菌为圆形光滑菌落，霉菌为绒毛状或絮状菌落，酵母菌为乳白色圆形菌落。选择菌落数30-300CFU的平板（此范围计数误差最小），若两个稀释度均符合，取平均值乘以稀释倍数（如1:10稀释平板平均200CFU，结果为200×10=2000CFU/mL？不对，等一下，原水样是1mL的话，1:10稀释是取1mL稀释液，所以是200×10=2000？不，原水样是1mL的话，1:10稀释液是1mL对应原水0.1mL，所以应该是200×10=2000？不对，正确计算是：稀释倍数=10^n，n是稀释次数，比如1:10是10^1，所以1mL稀释液对应原水1/10 mL，所以菌落数=平板菌落数×10^n。比如1:10稀释的平板有200CFU，那么原水是200×10=2000CFU/mL？不对，其实倾注法取1mL稀释液，所以稀释倍数是10，比如原水10mL加90mL生理盐水是1:10，取1mL稀释液等于取0.1mL原水，所以菌落数=平板数×10（因为1mL稀释液对应0.1mL原水，所以1mL原水就是平板数×10）。对，比如1:10稀释液取1mL，平板有200CFU，那么原水1mL就是200×10=2000CFU/mL。

特殊情况处理：若所有平板>300CFU，取最高稀释度（如1:1000）的平均菌落数×稀释倍数；若所有平板<30CFU，取最低稀释度（如原水）的平均菌落数×1；若菌落蔓延，需重新采样检测或选择更高稀释度。

结果判断的标准依据

需符合GB 8537-2018《饮用天然矿泉水》要求：细菌总数≤100CFU/mL，霉菌酵母菌≤10CFU/mL，大肠菌群≤0MPN/100mL（不得检出），致病菌（沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等）不得检出。

平行平板结果差值需≤20%（如两个平板分别为90和110CFU，差值20%，符合要求）；大肠菌群初筛产酸产气需复发酵（转种伊红美蓝平板，观察紫黑色带金属光泽菌落，再做生化试验确认）；霉菌若有黑色黏液状菌落，需鉴定是否为致病菌。

异常情况的处理流程

若空白对照（无菌生理盐水）出现菌落，说明环境或试剂污染，需重新消毒超净台、更换培养基，确认无菌后重测。若样品菌落数超标（如细菌150CFU/mL），需复样：取同批次另一样品重测，若仍超标则判定不合格；若合格，需检查稀释操作或培养温度是否有误。

若培养基促生长试验失败（标准菌株不生长），说明培养基质量问题，需重新配制并验证；若接种时污染（如移液器头碰台面），需丢弃该平板，重新接种。大肠菌群复发酵若仍阳性，需用API生化鉴定条确认是否为大肠菌群。