CLSI EP09指南在临床前性能验证方法比对中的应用要点

CLSI EP09-Ed4《用患者样本进行方法比对和偏倚估计》是临床检验领域方法学性能验证的核心指南，其以“真实样本”“统计可靠性”“临床相关性”为核心逻辑，直接指导待评方法与参比方法的结果一致性评估。在临床前性能验证中，方法比对是确认待评方法准确性的关键环节——唯有通过严谨的样本选择、设计实施与数据处理，才能识别系统误差（偏倚），为后续临床应用提供可信依据。本文结合临床前验证的实际场景，拆解EP09指南应用的核心要点，助力研究者规范完成方法比对。

临床前方法比对中样本选择的关键原则

样本是方法比对的基础，其质量直接决定结果可靠性。EP09强调样本需覆盖待评方法的“全检测区间”：从检测下限（LOD）到线性上限的完整浓度范围，且必须包含正常、异常及医学决定水平（如诊断cutoff值）的样本。例如检测心肌肌钙蛋白I（cTnI）时，样本应涵盖<0.04ng/mL（正常上限）、0.04-0.5ng/mL（灰区）及>0.5ng/mL（阳性）的浓度，确保不同临床场景下的偏倚均能被捕捉。

真实临床样本的使用是另一核心原则。校准品或质控品的基质（如牛血清白蛋白）与临床样本（人血清/血浆）存在差异，易引发“基质效应”——即使校准品比对结果良好，临床样本仍可能出现偏差。因此，临床前比对应优先选择新鲜、无溶血/脂血/黄疸的真实患者样本；若需使用冻存样本，必须预先验证稳定性（如反复冻融3次后结果偏差≤5%），避免样本降解引入误差。

样本的同质性也需严格控制。同一患者的样本应同时用于参比方法与待评方法检测，避免因样本差异导致结果偏移。例如检测血糖时，不可将同一患者的血清分两份分别冻存后用于不同方法，而应采集后立即分装、同时检测或统一冻存，确保两份样本的基质与浓度一致。

比对方法的设计与实施要点

参比方法的选择是比对设计的第一步。EP09要求参比方法需为“金标准方法”（如质谱法用于激素检测）或已通过严格验证的成熟方法（如获NMPA批准的化学发光法）。待评方法与参比方法的检测原理应尽量互补（如待评方法为免疫层析，参比方法为化学发光），避免因原理相同导致共同误差被遗漏。

样本量需满足统计效力要求。EP09推荐至少40个样本——样本量过少会升高假阴性率（漏诊真实偏倚）。例如当真实偏倚为5%时，40个样本的统计效力约80%，而20个样本仅约50%。若样本收集困难（如罕见病标志物），可通过增加重复检测次数（每个样本测2次取均值）弥补，但样本量仍需≥30个。

检测顺序的随机化是避免“顺序误差”的关键。不可先测完所有参比样本再待测评样本，而应采用“随机编号+交替检测”：将40个样本随机编号，先测参比方法1号，再待测评方法1号，接着参比方法2号……避免仪器漂移或操作者疲劳导致的结果偏差。

重复检测的应用需结合结果变异情况。当待评方法的批内变异系数（CV）>5%时，应对每个样本重复检测2次取均值——这可减少随机误差对偏倚估计的影响。例如检测CA125时，若待评方法批内CV为8%，重复2次后均值CV可降至5.7%，更接近真实值。

数据处理与统计分析的规范流程

数据初步核查是统计分析的前置步骤。首先检查完整性：所有样本需同时有参比与待评结果，缺失值需查明原因（如操作错误），若缺失超过5%需补充样本。其次是离群值判断：EP09推荐用Dixon检验（小样本）或Grubbs检验（大样本），但离群值仅在确认是操作错误时方可剔除，否则需保留并注明。

相关性分析是判断方法线性关系的基础。EP09要求Pearson相关系数（r）≥0.975——若r<0.975，说明样本浓度范围未覆盖全检测区间，或待评方法与参比方法线性关系差，需补充样本或重新选择参比方法。例如检测TSH时，若样本仅涵盖0.5-5μIU/mL（正常范围），r可能仅0.8；补充0.1μIU/mL（甲减）与10μIU/mL（甲亢）样本后，r可升至0.98。

回归分析是偏倚估计的核心工具。EP09优先推荐Passing-Bablok回归——与普通线性回归（LR）不同，它不假设数据正态分布，对离群值耐受性更强，更适合临床样本的非正态特征。通过回归方程（y = bx + a）可判断偏倚类型：截距a≠0表示恒定偏倚（如试剂空白过高），斜率b≠1表示比例偏倚（如校准曲线斜率不准确）。

医学决定水平处的偏倚计算是临床相关性的关键。EP09要求在1-3个医学决定水平（如诊断、治疗监测临界值）处计算偏倚，而非仅看整体偏倚。例如检测cTnI时，需计算0.04ng/mL（排除心梗）与0.5ng/mL（确诊心梗）处的偏倚：若0.04ng/mL处偏倚为10%（待评结果0.044ng/mL），可能导致假阳性；若0.5ng/mL处偏倚为-15%（待评结果0.425ng/mL），可能导致假阴性，均需重视。

偏倚评估与可接受性判断的核心逻辑

偏倚的统计学显著性与临床可接受性需分开判断。通过Passing-Bablok回归可得到截距与斜率的95%置信区间（CI）：若截距CI包含0，说明恒定偏倚无统计学意义；若斜率CI包含1，说明比例偏倚无统计学意义。但统计学无意义不代表临床可接受，需结合临床允许误差判断。

临床允许误差的制定需基于“临床影响”。EP09推荐参考三类标准：①CLIA88允许误差（如血糖±10%）；②生物学变异（如血红蛋白个体内变异2.5%，允许误差设为±5%）；③临床专家共识（如cTnI允许误差≤10%，否则影响心梗诊断）。例如待评方法偏倚为8%，若CLIA88允许误差±10%则可接受，若允许误差±5%则不可接受。

需注意“总偏倚”的评估——即恒定偏倚与比例偏倚的叠加。例如待评方法回归方程为y=1.05x+0.2，医学决定水平x=10时，总偏倚为（1.05×10+0.2）-10=0.7（7%）。若允许误差±5%，则总偏倚超过标准，需调整待评方法的校准参数（如降低斜率至1.0，调整截距至0）后重新比对。

特殊情况的处理策略：非线性与基质效应

当待评方法存在非线性时（如免疫层析法高浓度区的Hook效应），需缩小比对浓度范围至线性区间。EP09建议通过线性验证确定待评方法的线性范围（如cTnI线性范围0.01-50ng/mL），仅在该范围内进行比对。若线性范围外样本需检测，需采用稀释法并验证稀释准确性（如10倍稀释回收率90%-110%）。

基质效应是临床前比对中常见的干扰因素。EP09推荐用“差值plot”（待评结果-参比结果vs参比结果）识别：若某类样本（如溶血样本）的差值明显偏离其他样本，说明存在基质效应。例如检测总胆红素时，溶血样本待评结果比参比结果高20%，而正常样本差值仅5%，需进一步验证溶血对结果的影响（如用不同溶血程度样本测试，确定溶血指数临界值）。

对于存在基质效应的样本，需采取针对性措施：①优化待评方法试剂配方（如添加溶血抑制剂）；②在检测报告中注明“溶血样本结果可能偏高”；③若基质效应无法消除，需限制待评方法的适用范围（如仅用于无溶血样本）。

临床前比对中常见误区的规避

误区一：用校准品代替临床样本。校准品基质与临床样本不同，易引发“假阴性”偏倚——即使校准品比对结果良好，临床样本仍可能偏差大。例如检测CRP时，校准品为重组蛋白，而临床样本中CRP与血清蛋白结合，待评方法可能无法有效检测结合态CRP，导致结果偏低。

误区二：忽略样本随机检测。若按顺序检测参比与待评样本（如先测完所有参比再待测评），可能因仪器漂移导致结果偏差。例如上午仪器状态稳定，参比结果偏低；下午仪器漂移，待评结果偏高，导致偏倚被高估。

误区三：仅用相关性分析判断一致性。相关性仅反映线性关系，不反映偏差大小。例如待评方法结果始终比参比高20%，r=0.99，但偏倚达20%，若允许误差±5%则不可接受。因此需结合回归分析与偏倚计算。

误区四：未验证样本稳定性。冻存样本可能因降解导致结果偏差，例如检测胰岛素时，冻存1个月样本浓度下降15%，若未验证稳定性直接用于比对，会错误估计待评方法的偏倚。因此冻存样本需先验证稳定性（如0、7、14、28天检测，偏差≤5%）。