CLSI EP15指南临床前性能验证中精密度与准确性要求

CLSI EP15-A3《用户对体外诊断试剂和检测系统的性能验证》是临床实验室及IVD制造商开展临床前性能验证的核心指南，其中精密度与准确性作为评估检测系统可靠性的两大核心指标，直接决定试剂是否能满足临床诊断需求。临床前验证阶段通过严格遵循EP15的要求，可提前识别检测系统的变异来源与偏差风险，避免上市后因性能不稳定导致的误诊或漏诊。本文结合EP15的具体条款，详细拆解精密度与准确性验证的实施细节、样本设计、可接受标准及常见问题解决路径。

CLSI EP15中精密度验证的维度与试验要求

精密度是检测系统重复检测同一样本时结果的一致性，EP15将其分为批内（Within-run）、批间（Between-run）、日内（Within-day）与日间（Day-to-day）四个维度。批内精密度聚焦“短时间、同批次”的变异，要求使用同一批次试剂、同一台仪器，在1小时内对同一样本重复检测至少20次；批间精密度为“同一日、不同批次”的变异，需在同一天内更换试剂批次，对同一样本检测至少10次（每批次2次）；日内精密度是“同一日、不同时间”的变异，通常每天分上下午各检测1次，共至少5次；日间精密度则是“不同日、不同条件”的变异，要求连续5天，每天对同一样本检测2次，覆盖仪器校准、环境温湿度变化等因素。

EP15对精密度验证的样本提出明确要求：至少选择两个浓度水平，其中一个必须是医学决定水平——即对临床诊断、治疗决策有关键意义的浓度值（如肌钙蛋白I的0.5ng/mL，用于判断心梗）。例如血糖检测的精密度验证，需同时纳入5mmol/L（正常水平）与11mmol/L（糖尿病诊断阈值）的样本，确保覆盖临床最关注的浓度范围。

试验过程中，EP15强调“控制变量”：仪器需提前校准并通过质控，试剂批号保持一致（批间精密度除外），样本需在试验期间保持稳定（如血清样本4℃冷藏，避免蛋白降解）。试验结束后，需计算各维度的变异系数（CV）——即标准差（SD）与均值的比值，因为CV能更客观反映不同浓度样本的相对变异，而SD仅适用于同一浓度的绝对变异。

精密度验证的样本设计与误差控制细节

样本类型的选择需严格匹配检测目的：如检测血清胱抑素C，需使用血清样本而非血浆（EDTA抗凝剂可能影响检测结果）；尿液蛋白检测则需收集新鲜中段尿，避免细菌污染导致的蛋白降解。浓度选择上，除医学决定水平外，另一浓度通常为“正常参考范围上限”或“病理高值”，例如检测促甲状腺激素（TSH），可选择0.5mIU/L（正常下限）与5mIU/L（亚临床甲减阈值）的样本。

样本稳定性是精密度验证的关键前提。EP15要求，试验前需验证样本在存储条件下的稳定性——如将样本分装后冻存于-20℃，连续5天检测其浓度变化，若CV≤2%则视为稳定。若样本易降解（如RNA检测的血浆样本），需在采集后1小时内完成检测，或添加RNA稳定剂。

试验过程中的误差需提前规避：例如批内精密度试验中，不可中途更换检测人员或调整仪器参数；日间精密度试验中，每天需先做质控品检测，确保仪器处于正常状态后再检测样本。若某批次质控结果超出可接受范围，该批次的样本检测结果需剔除，重新进行试验。

准确性验证的核心方法与EP15的实施规范

准确性是检测结果与“真实值”的接近程度，EP15推荐三种验证方法：对比试验、回收试验与干扰试验。对比试验是最常用的方法——通过将待验证试剂与参考方法（如ISO 15193认可的参考测量程序）或已上市的“金标准”试剂同时检测同一样本，评估结果的一致性。EP15要求对比试验的样本量至少40个，且覆盖待验证试剂的线性范围（如检测范围为0-200ng/mL的肿瘤标志物，样本需包含0-50ng/mL、50-150ng/mL、150-200ng/mL三个区间）。

回收试验用于评估检测系统对“添加物”的回收率——即向样本中添加已知量的分析物（如向血清中添加100μmol/L的尿酸），检测添加后的浓度，计算回收率（回收率=（检测值-基础值）/添加值×100%）。EP15要求回收试验至少选择三个添加水平（低、中、高），每个水平重复3次，回收率需在85%-115%之间（部分项目可放宽至80%-120%，如药物浓度检测）。

干扰试验聚焦“外源性物质”对结果的影响——即向样本中添加临床常见的干扰物（如血红蛋白、胆红素、甘油三酯、药物代谢物），检测干扰前后的结果偏差。例如检测肝功能的AST，需评估胆红素（200μmol/L）、血红蛋白（5g/L）、甘油三酯（10mmol/L）的干扰：若添加胆红素后AST结果偏差超过10%（可接受标准），则说明该试剂对高胆红素样本的检测准确性不足。

对比试验的设计要点与统计分析要求

对比方法的选择需符合“溯源性”要求：参考方法需可溯源至国际单位制（SI）或权威参考物质（如NIST的标准物质）；若使用已上市试剂作为对比方法，该试剂需通过FDA或CE认证，且性能参数（如精密度、准确性）已被验证。例如检测血糖，参考方法为己糖激酶法，对比试剂为已上市的葡萄糖氧化酶法试剂。

样本的浓度分布需“均匀覆盖”：避免集中在某一浓度区间（如仅检测正常血糖样本，无法评估糖尿病高值样本的准确性）。例如检测糖化血红蛋白（HbA1c），样本需包含4%（正常）、6.5%（糖尿病诊断阈值）、10%（血糖控制不佳）三个水平，确保覆盖临床所有可能的决策点。

统计分析需遵循EP15的要求：首先绘制散点图，观察结果的线性趋势；然后进行回归分析，计算相关系数（r）、斜率（b）与截距（a）。理想情况下，r应≥0.99（说明结果一致性好），b应接近1（说明无比例偏差），a应接近0（说明无恒定偏差）。例如某血糖试剂的回归方程为y=0.98x+0.12，r=0.997，说明该试剂的准确性良好——结果仅比参考方法低2%，且恒定偏差仅0.12mmol/L。

干扰试验的干扰物选择与结果判断标准

干扰物的选择需基于“临床常见性”：内源性干扰物包括血红蛋白（溶血样本）、胆红素（黄疸样本）、甘油三酯（脂血样本）、蛋白质（高蛋白血症）；外源性干扰物包括药物（如维生素C影响血糖检测）、防腐剂（如肝素影响凝血功能检测）。EP15要求，干扰物的浓度需设定为“临床常见高值”——如血红蛋白的干扰浓度为5g/L（对应中度溶血），胆红素为200μmol/L（对应重度黄疸），甘油三酯为10mmol/L（对应重度脂血）。

干扰试验的设计需采用“配对样本”：即取一份无干扰的基础样本，分成两份，一份添加干扰物（试验样本），另一份不添加（对照样本），同时用待验证试剂检测，计算偏差（偏差=（试验值-对照值）/对照值×100%）。例如某ALT试剂检测添加胆红素（200μmol/L）的样本，结果为45U/L，对照样本为40U/L，偏差为12.5%——若可接受标准为≤10%，则该试剂对高胆红素样本的准确性不符合要求。

干扰试验的结果需结合“临床影响”判断：若偏差超过可接受标准，但该干扰物在临床中极少出现（如甘油三酯10mmol/L的样本仅占1%），可在试剂说明书中注明“避免检测脂血样本”；若干扰物常见（如血红蛋白5g/L的样本占10%），则需改进试剂配方（如添加溶血抑制剂），重新进行验证。

精密度与准确性的可接受标准制定逻辑

可接受标准的制定需基于三个维度：临床需求、制造商声称与行业标准。临床需求是最核心的依据——即偏差或变异是否会影响临床决策。例如肌钙蛋白I的检测，临床要求结果偏差≤10%（因为0.5ng/mL与0.55ng/mL的差异会影响心梗的诊断），因此精密度CV需≤10%，准确性偏差需≤10%。

制造商声称是“合同义务”：若制造商在说明书中声称“批内精密度CV≤3%，准确性偏差≤5%”，则验证结果必须满足该要求——若批内CV为4%，即使符合临床需求，也视为不符合EP15的要求，需要求制造商改进或调整声称。

行业标准是“最低要求”：例如CLIA'88（美国临床实验室改进修正案）规定，血糖检测的总允许误差（TEa）为±10%或±0.33mmol/L（取较严者），因此血糖试剂的精密度CV需≤5%（通常取TEa的一半），准确性偏差需≤5%。若某血糖试剂的批内CV为6%，则未达到CLIA'88的要求，无法通过验证。

验证过程中的常见问题与EP15的解决路径

问题1：精密度验证的样本浓度不足。例如仅选择了一个正常浓度的样本，未包含医学决定水平。解决方法：补充医学决定水平的样本（如血糖的11mmol/L），重新进行试验——EP15要求至少两个浓度水平，否则无法评估不同浓度下的精密度。

问题2：对比试验的样本量不够。例如仅检测了20个样本，未达到EP15的40个要求。解决方法：补充样本至40个，且确保覆盖线性范围——若样本难以收集，可使用“稀释样本”（如将高浓度样本用生理盐水稀释至低浓度），但需验证稀释后的样本是否符合检测要求。

问题3：干扰试验的偏差超过可接受标准。例如某ALT试剂对胆红素的偏差为15%，超过10%的可接受标准。解决方法：首先确认干扰物的浓度是否合理（如胆红素是否为200μmol/L），若合理，则需改进试剂配方——如添加胆红素氧化酶，分解样本中的胆红素，重新进行干扰试验；若无法改进，则需在说明书中注明“黄疸样本需稀释后检测”。

问题4：统计分析错误。例如用SD代替CV计算精密度。解决方法：重新计算CV——对于不同浓度的样本，SD无法反映相对变异（如10mmol/L的血糖SD=0.2mmol/L，CV=2%；5mmol/L的血糖SD=0.1mmol/L，CV=2%，两者的相对变异相同，但SD不同）。EP15明确要求，精密度需用CV表示，除非样本浓度恒定（如质控品）。