免疫层析试剂临床前性能验证的最低检出限验证实验

免疫层析试剂因快速、便捷的特点，广泛应用于病原体检测、肿瘤标志物筛查等临床场景，其灵敏度直接决定早期诊断或低浓度样本的检测准确性。最低检出限（LOD）作为灵敏度的核心指标，是临床前性能验证的关键——它反映试剂在统计学置信度下能稳定检测出的最低 analyte 浓度，是试剂能否满足临床需求的“门槛”。本文围绕免疫层析试剂LOD验证实验的设计、实施及关键控制点展开，为试剂研发及注册检验提供实操指引。

最低检出限的定义与临床价值

最低检出限（LOD）并非“偶尔测出”的浓度，而是统计学上95%置信度下，试剂能稳定检出的最低浓度——需区别于定量限（LOQ，侧重准确定量），LOD更关注“有无”的定性判断。例如，新冠抗原试剂的LOD若为25 TCID₅₀/mL，意味着95%的情况下能检测出≥25 TCID₅₀/mL的病毒样本；若LOD为50 TCID₅₀/mL，则可能漏检早期低载量感染者。

从临床角度看，LOD直接影响诊断的敏感性：LOD越低，试剂能覆盖的早期或轻微病变越多（如肿瘤标志物AFP的LOD低，能更早筛查出肝癌）；但过低的LOD也可能增加假阳性风险（如检测到非致病性的低浓度病原体），因此需在灵敏度与特异性间找到平衡——这也是LOD验证需严格设计的原因。

实验设计的前提准备

LOD验证需基于“真实试剂+真实样本+标准环境”原则，前期需完成三项准备：其一，试剂选择——需使用中试或量产批次（而非研发小试产品），确保层析膜孔径、胶体金标记量等关键参数均一，避免批次差异影响结果；其二，设备校准——定量试剂需用计量认证的读数仪（如荧光读数仪），定性试剂需统一判读标准（如“条带出现即为阳性”）；其三，参考品制备——需用临床真实基质（如全血检测用EDTA抗凝血），且溯源至有证参考物质（CRM），保证浓度准确。

例如，检测血清AFP的试剂，参考品需用正常人血清稀释AFP标准品至梯度浓度，而非PBS缓冲液——因血清中的白蛋白、球蛋白能模拟临床样本的干扰环境，确保验证结果贴近真实应用场景。

梯度浓度样本的制备策略

梯度浓度需围绕“理论LOD”展开：研发阶段通过预实验得到初步LOD（如50 ng/mL），验证实验需设置5-8个梯度，覆盖“空白-低浓度-接近理论LOD-略高于理论LOD”的范围。例如，初步LOD为50 ng/mL，可设置0 ng/mL（空白）、10 ng/mL、25 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL五个梯度——其中25 ng/mL为“低于理论LOD”，50 ng/mL为“理论LOD”，100 ng/mL为“高于理论LOD”。

制备时需注意逐步稀释法：将高浓度标准品（如1000 ng/mL）用基质溶液逐步稀释（如先稀释10倍得100 ng/mL，再稀释2倍得50 ng/mL），避免一次性稀释导致的浓度偏差。每步稀释需涡旋振荡30秒，确保参考品均匀；同时，空白样本需用与参考品基质一致的溶液（如正常人血清），而非纯水——因基质成分会影响免疫反应的背景信号。

实验操作的标准化与重复要求

操作标准化是结果可靠的关键，需严格遵循试剂说明书的SOP：其一，加样量——如说明书要求加100μL，需用校准移液枪准确量取，避免溢出或量不足；其二，孵育条件——如说明书要求15分钟孵育，需用计时器控制，避免温度（15-30℃）或湿度（40-60%）波动；其三，读取时间——需在15-20分钟内判读，超时会导致信号减弱（如胶体金沉降）或增强（如非特异性结合）。

重复次数需满足统计学要求：每个浓度至少做20次独立重复（确保95%置信度），空白样本也需做20次——例如，20次重复中，某浓度有19次阳性（95%），结合统计分析可确定LOD。操作人员需培训：加样时垂直于加样孔，避免气泡；孵育时平放检测卡，避免样本倾斜扩散。

数据统计与LOD计算方法

LOD计算需结合试剂的定性/定量属性选择方法：

定性试剂（如新冠抗原卡）用Probit回归分析：将浓度转换为对数，阳性率转换为Probit值（95%阳性率对应Probit值约1.645），拟合回归方程后，计算对应95%阳性率的浓度。例如，回归方程为Y=0.6X+0.5，当Y=1.645时，X≈1.908，对应原始浓度为10¹·⁹⁰⁸≈80 ng/mL——此即为LOD。需注意，Probit分析的相关性系数R²需≥0.9（说明拟合良好）。

定量试剂（如CRP定量卡）用“3SD法”：检测20次空白样本的信号值，计算平均值（μ）和标准偏差（SD），LOD=μ+3SD——即信号值超过此值可判定为阳性。若空白信号分布不均，需改用非参数法（如第95百分位数）。

统计过程需记录关键参数（如R²、SD），这些是验证结果有效的依据——例如，空白样本SD≤10%，说明背景信号稳定。

实验中的影响因素及控制

LOD结果易受三方面干扰，需针对性控制：

其一，样本基质干扰：全血中的血红蛋白会吸附在层析膜上，阻碍抗原-抗体复合物迁移，导致低浓度样本条带变浅。控制方法：参考品需用临床真实基质（如EDTA抗凝血），若试剂用于不同基质（血清、血浆），需分别验证LOD。

其二，环境因素：温度过低（<15℃）会减慢反应，过高（>30℃）会加速蒸发；湿度过高（>60%）会使层析膜受潮，过低（<40%）会减慢样本扩散。控制方法：实验需在恒温恒湿箱（20-25℃，40-60%）中进行，或提前将试剂平衡至室温。

其三，操作差异：加样速度、孵育时间不一致会导致结果波动。控制方法：制定SOP，培训操作人员，实验前进行一致性测试（2名操作人员检测同一浓度，结果一致率≥90%）。

常见问题的解决策略

实验中常遇到三类问题，需针对性解决：

1、空白对照阳性：可能是试剂污染（如检测卡被样本污染）或空白样本污染。解决方法：更换试剂批次，重新制备空白样本，并用新实验台操作；若仍阳性，需检测空白样本的 analyte 浓度（如质谱法）。

2、低浓度阳性率波动大：可能是参考品不均、移液枪未校准或操作不一致。解决方法：检查参考品均匀性（不同部位浓度差异≤5%）；校准移液枪（误差≤1%）；增加重复次数至30次。

3、LOD高于预期：可能是试剂灵敏度不足（如抗体亲和力低）、参考品降解或统计错误。解决方法：更换抗体批次，验证参考品稳定性（0天与7天浓度差异≤10%），重新核对统计过程（如Probit值查询是否正确）。

验证结果的判定与记录

LOD结果需满足两项要求：其一，符合技术要求——即LOD不高于试剂说明书或注册标准的规定值（如新冠抗原试剂LOD≤50 TCID₅₀/mL）；其二，过程规范——操作遵循SOP，统计方法正确，影响因素已控制。

验证需详细记录：试剂批次、参考品信息（基质、浓度）、实验环境（温湿度）、操作人、重复结果、统计参数（R²、SD）——这些记录是注册检验的重要依据，需保留至少10年。若试剂用于不同人群（成人/儿童）或样本类型（鼻咽拭子/唾液），需分别验证LOD，确保覆盖所有临床应用场景。