免疫诊断试剂临床前性能验证的线性范围验证技术流程

线性范围是免疫诊断试剂的核心性能指标之一，直接关系到检测结果能否准确反映样本中目标分析物（如肿瘤标志物、激素、病原体抗原）的真实浓度。临床前性能验证中的线性范围验证，是通过科学设计浓度梯度、规范检测流程与统计分析，确认试剂在预期浓度范围内检测结果与分析物浓度呈线性关系的关键步骤。该验证不仅是试剂注册的必备环节，也是确保试剂在临床应用中为疾病诊断、疗效监测提供可靠数据的重要保障。

线性范围验证的前期准备

线性范围验证开始前，首先需要全面熟悉待验证试剂的说明书内容。说明书中会明确试剂的预期线性范围、适用样本类型（如血清、血浆）、检测方法原理（如ELISA、化学发光）及关键操作参数（如孵育温度、时间），这些是设计验证方案的核心依据。例如，某心肌肌钙蛋白I（cTnI）试剂标注预期线性范围为0-50ng/mL，验证时需确保浓度梯度覆盖该范围，并延伸至临界值上下，以确认线性完整性。

实验器材与试剂的准备是准确性基础。检测仪器需提前校准，如化学发光分析仪需用厂家校准品验证光路、加样系统的稳定性；校准品应溯源至国际或国家参考物质（如WHO参考品），且在有效期内；质控品需选择匹配的低、中、高值，用于监控实验稳定性。此外，移液枪、离心机等辅助器材需检查状态，移液枪需校准精度（≤1%）。

操作人员培训不可忽视。验证对操作重复性要求极高，如加样量误差1μL可能导致浓度梯度偏离设计值。操作人员需提前熟悉检测流程，包括样本加样、试剂添加、孵育、洗涤等步骤的标准操作，同时掌握数据记录规范，确保每一步可追溯。

最后需制定详细验证方案，明确实验时间、样本数量、浓度点设计及统计方法，方案需经内部审核，符合《体外诊断试剂性能评价指南》等法规及实验室质量体系要求。

样本的选择与处理规范

样本类型需严格遵循说明书要求，避免基质差异引入误差。如试剂指定用血清，则不能用含抗凝剂的血浆（可能干扰抗原-抗体结合）；若允许血浆，需明确抗凝剂类型（如EDTA-K2）。样本优先选临床剩余新鲜样本，基质更接近真实场景，但需确保分析物浓度覆盖验证范围，且无溶血、脂血、黄疸等干扰（可通过目视或仪器检测确认）。

若临床样本难以覆盖浓度范围，可使用模拟样本（校准品或高浓度样本稀释）。模拟样本基质需与临床样本一致，如用血清基质校准品稀释，避免基质不同导致结果偏差。例如，某CA125高浓度样本（300U/mL），用阴性血清稀释成150、100、50U/mL等梯度，确保基质一致。

样本处理需按标准流程：血清样本采集后2小时内离心（3000rpm，10分钟），分离后立即检测或分装冻存（-20℃/-80℃），避免反复冻融（≤2次）。冻存样本检测前需完全解冻并充分混匀，避免气泡或浓度不均。

样本质量控制需同步进行：每批检测运行质控品，若结果超出±2SD范围，说明过程存在问题，需重新处理样本或排查原因（如试剂失效、仪器故障）。

浓度梯度的科学设计

浓度梯度需满足“覆盖预期范围、分布均匀、数量足够”原则。CLIA'88要求至少5个点，建议6-8个点以提高统计可靠性。例如，血糖试剂预期范围2.8-22.2mmol/L，可设计2.8、6.1、11.1、16.7、22.2、27.8mmol/L（覆盖预期并延伸上限）。

浓度点需覆盖预期上下限，中间点均匀分布。如预期0-200ng/mL，设置0、40、80、120、160、200六个点，能全面反映线性趋势；若仅设0、100、200三个点，无法判断中间浓度的线性。

稀释需准确：用高精度移液设备，采用“逐步稀释法”减少累积误差。例如，1mL 200ng/mL样本加1mL稀释液得100ng/mL，再取1mL 100ng/mL加1mL稀释液得50ng/mL，依次类推。

稀释液需与说明书一致，避免成分不同导致偏差。如试剂推荐专用稀释液（含蛋白稳定剂），若用生理盐水代替，可能因基质效应导致低浓度点结果偏低。

检测操作与数据采集要求

检测前需确保仪器状态：化学发光仪预热30分钟，ELISA酶标仪校准吸光度，试剂平衡至室温（20-25℃）。每批检测同时运行校准品和质控品，校准品建标准曲线，质控品验证实验有效性——若质控超出±2SD，需停实验排查原因（如试剂失效、仪器故障）并重新检测。

操作需严格遵循说明书：加样量（如10μL样本+100μL试剂）准确，避免气泡；孵育时间（37℃15分钟）严格计时；洗涤充分（ELISA洗5次，每次浸泡30秒）；显色/发光时间精准（ELISA显色10分钟后立即终止）。

每个浓度点需重复检测2-3次，减少随机误差。重复时用同一批次试剂和样本，避免批次差异。例如，某浓度点测3次得吸光度0.321、0.318、0.325，取平均值或用所有重复值统计。

数据采集需及时准确：记录样本编号、浓度点、检测日期、仪器编号、操作人员、试剂/校准品批号、质控结果、每个重复的实测值（吸光度或浓度）。数据直接记在LIS或纸质原始记录上，避免二次转录错误。若出现异常（如某重复值差异超20%），需立即检查操作（如加样有误）并重新检测。

数据的统计分析方法

线性回归分析是核心方法：用最小二乘法拟合实测值（y轴）与预期浓度（x轴）的线性方程（y=a+bx），计算决定系数（R²）和相关系数（r）。R²衡量线性拟合优度，代表实测值变异中可由线性模型解释的比例，通常要求≥0.99（高灵敏度试剂可能要求≥0.995）。

相对偏差（RD）评估点准确性：RD=（实测值-预期值）/预期值×100%，要求绝对值≤10%（或试剂规定范围）。例如，预期100ng/mL，实测95ng/mL，RD=-5%符合要求；若实测85ng/mL，RD=-15%则超标。

残差分析补充验证：残差是实测值与回归预测值的差值，若残差随预期浓度递增/递减，说明非线性。例如，残差随浓度增大而增大，可能是高浓度样本有钩状效应，需稀释后重测。

需注意，若用吸光度值拟合，需先将吸光度转换为浓度（通过校准曲线），再进行线性分析；若直接用吸光度拟合，需确保吸光度与浓度呈线性关系（如ELISA法的吸光度在一定范围内与浓度线性相关）。

线性范围的结果判断依据

结果需同时满足两点：一是R²≥0.99（或说明书更高标准）；二是所有浓度点RD绝对值≤10%。仅同时满足，才能确认线性符合预期。

验证范围需完全覆盖预期范围。例如，试剂预期0-200ng/mL，若验证发现200ng/mL点RD=-18%（超标），说明实际线性上限180ng/mL，不符合预期，需调整试剂配方或优化方法。

超出预期的点（如250ng/mL）若RD≤10%，说明线性可延伸，但需在说明书注明“建议稀释后检测”。例如，某试剂预期0-200ng/mL，250ng/mL点RD=-8%，可补充“浓度超200ng/mL需稀释1倍，结果乘2”。

若结果不符，需分析原因：R²不达标可能是浓度点少或操作误差，需增加点或优化操作；某点RD超标可能是样本处理不当或仪器波动，需重测或校准仪器。

异常情况的识别与处理流程

常见异常包括离群值、R²不达标、某点RD超标。处理离群值：先查操作记录（如加样有误），若操作无错，重测2次，仍离群则分析样本质量（如变质）或仪器状态（如光路堵塞）。

R²不达标（如0.97）：先查浓度点设计（如数量少），若设计合理，查样本处理（如基质效应）或稀释准确性（如移液枪未校准），针对性解决后重验证。

某点RD超标（如160ng/mL点RD=-20%）：查样本处理（如离心不充分导致纤维蛋白残留）或操作（如孵育时间不足），纠正后重测。

所有异常处理需记录：包括异常现象、原因分析、纠正措施和最终结果，确保可追溯。例如，某样本160ng/mL点RD=-20%，经查是孵育时间不足，重孵15分钟后RD=-7%，需记录“因孵育时间不足导致异常，重测后符合要求”。

线性范围验证报告的撰写要点

报告需包括：基本信息（试剂名称、批号、预期线性范围、实验人员、检测日期、仪器信息）；实验方法（样本类型、浓度梯度、检测流程）；统计结果（线性方程、R²、各点预期值/实测值/RD）；结果判断（是否符合预期）；异常处理记录（若有）；结论（线性范围是否满足需求）。

报告需由实验人员和审核人员签字，盖实验室公章，保存至少5年（或遵当地法规）。例如，某试剂报告需写“本试剂线性范围0-200ng/mL，R²=0.998，各点RD绝对值≤8%，符合预期”。

若为注册用报告，需符合NMPA《体外诊断试剂注册申报资料要求及说明》，确保内容完整、数据真实、逻辑清晰，与注册资料关联。