透皮吸收测试中HPLC-MS联用技术在多成分同时定量分析中的实践

透皮吸收测试是药物经皮给药系统研发的核心环节，需精准定量皮肤及接收液中多成分的含量以评价渗透效率。HPLC-MS联用技术凭借高效液相色谱（HPLC）的分离能力与质谱（MS）的高灵敏度、特异性，成为多成分同时定量的首选工具。实践中，其应用需解决样品前处理、色谱分离、质谱调试及基质干扰等关键问题，本文围绕这些环节展开具体实践经验分享。

透皮吸收样品的前处理策略

透皮样品包括皮肤组织（角质层、表皮层、真皮层）与接收液（如磷酸盐缓冲液），其中皮肤组织含大量蛋白质、磷脂等基质，易干扰后续分析。前处理的核心是“高效提取目标成分+去除基质干扰”。以大鼠皮肤样品为例，先将皮肤剪成碎片，加入5倍体积的甲醇（含0.1%甲酸），用组织匀浆机高速匀浆3分钟（转速12000rpm），再超声提取15分钟（温度控制在25℃以下，避免热敏成分降解），随后12000rpm离心10分钟，取上清液过0.22μm有机滤膜。若基质干扰仍强，可采用固相萃取（SPE）进一步净化——选用Oasis HLB小柱（60mg/3mL），先用5mL甲醇活化，再上样，用5mL水冲洗，最后用5mL乙腈洗脱，洗脱液氮气吹干后用初始流动相复溶至1mL，进样分析。

接收液样品相对简单，但需注意浓缩：若目标成分浓度低，可将接收液用旋转蒸发仪浓缩至原体积的1/10（40℃水浴），再用甲醇稀释至合适浓度。提取溶剂的选择需兼顾目标成分的溶解度与基质兼容性——极性成分可选甲醇-水混合溶剂，非极性成分可选乙腈或乙酸乙酯；避免使用强腐蚀性溶剂（如三氯甲烷），防止损伤色谱柱或质谱离子源。

HPLC分离条件的针对性优化

多成分分离的关键是色谱柱与流动相的匹配。色谱柱优先选择小粒径（1.7-2.1μm）、短柱长（50-150mm）的C18柱（如Waters ACQUITY UPLC HSS T3），既保证分离效率，又适配质谱的低流速要求（0.3-0.5mL/min）。流动相需加入挥发性添加剂改善峰形与离子化效率——水相常用0.1%甲酸水（酸性成分）或0.1%氨水（碱性成分），有机相首选乙腈（比甲醇更易挥发，减少质谱接口处的残留）。

梯度洗脱程序需根据成分的极性调整：以6种黄酮类成分（槲皮素、山柰酚、异鼠李素等）为例，初始流动相为95% 0.1%甲酸水+5%乙腈，保持2分钟；随后在18分钟内线性升至95%乙腈，保持3分钟；最后回到初始比例平衡5分钟。流速设置为0.4mL/min，柱温35℃——流速过快会降低分离度，过慢则延长分析时间；柱温升高可改善峰形，但需避免超过40℃（防止柱床塌陷）。

MS检测参数的实践调试

质谱离子源优先选择电喷雾电离（ESI），因其适用于极性化合物，且兼容HPLC的流动相体系。离子模式需根据成分的pKa值选择：酸性成分（如黄酮类，pKa 5-7）用负离子模式（ESI-），碱性成分（如生物碱，pKa 8-10）用正离子模式（ESI+）。以ESI+模式为例，毛细管电压设置为3.5kV，喷雾气压（GS1）35psi，干燥气温度350℃，碰撞气（CAD）为medium（适中强度，避免过度碎裂）。

多反应监测（MRM）模式是定量的核心，需逐一优化每个成分的母离子、子离子与碰撞能量：先通过全扫描（Q1 Scan）找到目标成分的准分子离子（如槲皮素的[M+H]+为303.1）；再通过子离子扫描（Product Ion Scan）找到特征子离子（如槲皮素的151.1，为A环碎裂产物）；最后调整碰撞能量（CE）至子离子响应最高——槲皮素的CE为25eV，山柰酚（母离子287.1）的CE为22eV。每个成分的MRM通道需设置独立的驻留时间（Dwell Time），总驻留时间不超过500ms（避免扫描速率过慢导致峰型失真）。

基质效应的评估与消除

皮肤基质中的磷脂、蛋白质会抑制目标成分的离子化，导致响应降低（基质抑制）或升高（基质增强）。评估方法采用“基质匹配校准曲线法”：分别用空白皮肤提取液与纯溶剂配制系列标准溶液，绘制两条校准曲线，计算斜率比（基质曲线斜率/纯溶剂曲线斜率）——若斜率比在80%-120%之间，说明基质效应可接受；否则需优化前处理。

消除基质效应的常用方法：一是增加净化步骤，如将SPE小柱的洗脱体积从5mL增至8mL，或更换为更强保留的小柱（如Oasis MCX）；二是稀释样品，将提取液用初始流动相稀释5-10倍，降低基质浓度；三是采用同位素内标（如槲皮素-d3），通过内标与目标成分的响应比抵消基质效应——内标需与目标成分结构相似、保留时间相近，且不干扰样品分析。

实际透皮样品的分析实践

以某中药复方透皮贴剂的大鼠在体透皮实验为例，收集给药24小时后的皮肤样品（分离角质层与真皮层）与接收液样品。皮肤样品按前处理方法提取后，进样分析；接收液样品直接浓缩后进样。结果显示：角质层中槲皮素的浓度为12.5ng/mg，真皮层为3.2ng/mg，接收液为156ng/mL——符合“角质层滞留、真皮层渗透、接收液累积”的透皮规律。

实践中需注意异常数据的排查：若某样品的峰面积突然升高，需检查是否为溶剂污染（如甲醇含残留成分）；若峰形拖尾，需调整流动相的pH值（如增加甲酸浓度至0.2%）；若响应降低，需检查质谱离子源是否污染（定期用甲醇冲洗离子源，去除残留的盐类或有机物）。