透皮吸收测试中透皮吸收实验的干扰物质（防腐剂）排除方法研究

透皮吸收测试是评价经皮给药制剂有效性的核心环节，其结果直接影响制剂的研发与注册。然而，制剂中添加的防腐剂（如尼泊金酯类、苯扎溴铵等）常作为干扰物质，会与药物成分竞争检测通道、影响扩散池系统的稳定性，甚至干扰分析仪器的信号响应，导致实验数据偏差。因此，如何科学排除防腐剂对透皮吸收实验的干扰，成为保障实验准确性的关键问题。

防腐剂对透皮吸收实验的干扰机制与表现

透皮吸收实验中，防腐剂的干扰主要体现在三个层面：首先是对药物检测方法的干扰。多数防腐剂（如尼泊金甲酯、苯扎氯铵）具有紫外吸收或色谱保留行为，若与目标药物的吸收波长或保留时间接近，会导致高效液相色谱（HPLC）或紫外分光光度法（UV）的检测峰重叠，无法准确量化药物含量。例如，尼泊金乙酯的最大吸收波长约为254nm，若目标药物也在该波长下检测，两者的色谱峰易叠加，导致药物浓度计算值偏高。

其次是对扩散过程的影响。部分防腐剂具有表面活性，会改变皮肤角质层的脂质排列或扩散介质的表面张力。比如苯扎溴铵作为阳离子表面活性剂，可能与皮肤角质层的阴离子成分结合，破坏皮肤屏障的完整性，使药物的透皮速率异常升高；或因表面活性剂的增溶作用，增加药物在接收液中的溶解度，干扰“漏槽条件”的维持。

最后是对实验系统的间接干扰。防腐剂可能与扩散池的材质（如聚四氟乙烯、玻璃）发生吸附或反应，导致池内环境的pH值、渗透压变化，进而影响药物的稳定性。例如，尼泊金酯类在碱性条件下易水解，若扩散介质的pH因防腐剂降解而升高，可能导致药物（如酯类药物）的降解加速，进一步混淆实验结果。

防腐剂干扰排除的前提——目标防腐剂的定性与定量表征

排除防腐剂干扰的第一步，是明确制剂中防腐剂的种类与含量。常用的分析方法包括液相色谱-质谱联用（LC-MS）、气相色谱-质谱联用（GC-MS）和高效液相色谱（HPLC）。LC-MS可通过分子量和碎片离子峰准确鉴定防腐剂的化学结构，例如尼泊金甲酯的[M+H]+峰约为153.1，苯扎溴铵的[M]+峰约为384.3；GC-MS适用于挥发性防腐剂，但对非挥发性防腐剂（如尼泊金酯类）需先进行衍生化处理。

定量分析则需建立防腐剂的专属检测方法，避免与药物成分的干扰。例如，采用HPLC法时，可选择不同的色谱柱（如C18柱换为苯基柱）或流动相（如增加缓冲盐浓度、改变有机相比例），分离防腐剂与药物的色谱峰。比如分析尼泊金乙酯时，用0.1%甲酸水溶液-乙腈作为流动相梯度洗脱，使尼泊金乙酯的保留时间与目标药物拉开，再通过外标法计算其含量。

此外，需关注防腐剂在透皮实验过程中的变化：收集不同时间点的接收液和皮肤样本，用LC-MS检测防腐剂的含量，明确其在实验系统中的分布，为后续排除方法提供依据。

物理分离法——基于理化性质差异的防腐剂移除

物理分离法是通过防腐剂与药物的理化性质差异（如极性、溶解度、分子大小），将防腐剂从样品中移除。常用的方法包括液液萃取（LLE）和固相萃取（SPE）。

液液萃取适用于防腐剂与药物极性差异较大的情况。例如，若目标药物是极性小分子（如维生素B5），而防腐剂是弱极性的尼泊金酯类，可使用乙酸乙酯作为萃取溶剂：将接收液调节至酸性（尼泊金酯类在酸性条件下易溶于有机溶剂），加入乙酸乙酯振荡，尼泊金酯会转移至有机相，而极性药物留在水相。需注意萃取次数（通常2-3次）和pH控制，避免防腐剂解离导致分离失败。

固相萃取更适用于复杂样品（如皮肤提取液）。选择与防腐剂亲和力强的SPE小柱（如阳离子交换柱用于苯扎溴铵），样品过柱后用不同溶剂洗脱：例如，苯扎溴铵会与阳离子交换柱的磺酸基结合，用高浓度氯化钠溶液洗脱防腐剂，而药物随流出液收集。SPE的优势是回收率高（通常>85%），但需优化柱的种类和洗脱条件，避免药物损失。

膜分离法适用于分子量差异显著的情况。例如，苯扎溴铵（分子量约384Da）远大于药物（如咖啡因约194Da），可使用截留分子量为300Da的超滤膜，离心过滤后药物透过膜，防腐剂被截留。需验证膜对药物的吸附率（<5%）。

化学抑制法——通过化学反应消除防腐剂的干扰活性

化学抑制法是利用化学反应将防腐剂转化为无干扰的物质，常用策略包括络合、水解和氧化反应。

络合反应适用于阳离子防腐剂（如苯扎溴铵）。用阴离子络合剂（如十二烷基硫酸钠，SDS）与阳离子结合，形成不溶性络合物沉淀，离心或过滤去除。需控制SDS用量（防腐剂浓度的1-2倍），避免过量SDS影响药物检测。

水解反应适用于酯类防腐剂（如尼泊金酯类）。尼泊金酯类在碱性条件下易水解为对羟基苯甲酸和醇，若药物对碱性稳定，可将样品调至pH 9-10，加热30分钟使防腐剂完全水解。水解后的对羟基苯甲酸可用液液萃取去除，水相中的药物即可准确检测。

氧化反应适用于易被氧化的防腐剂（如硫柳汞）。用过氧化氢（H2O2）氧化硫柳汞的硫代水杨酸基团，生成无紫外吸收的物质。需验证H2O2不会氧化目标药物。

检测方法优化——从分析端规避防腐剂的干扰

若无法移除防腐剂，可通过优化检测方法规避干扰，主要策略包括选择专属检测波长、使用质谱检测器或衍生化处理。

专属检测波长选择：扫描药物与防腐剂的紫外光谱，选择药物有强吸收而防腐剂无吸收的波长。例如，药物最大吸收波长为320nm，而尼泊金乙酯在该波长吸光度低，可避免干扰。

质谱检测器（如LC-MS/MS）可彻底规避色谱峰重叠。通过多反应监测（MRM）模式仅检测药物的特征离子对，防腐剂的离子信号不会被采集。例如，检测药物A时选择母离子m/z 200和子离子m/z 150，防腐剂的离子不会被监测，即使色谱峰重叠也能准确量化。

衍生化处理适用于无紫外吸收的药物。例如，胺类药物用乙酸酐衍生生成有强紫外吸收的衍生物，而防腐剂不发生反应，选择衍生物的吸收波长检测即可避免干扰。需优化衍生化条件，确保药物完全衍生。

实验系统调整——从源头上减少防腐剂的干扰

调整实验系统本身也能减少防腐剂的干扰，主要策略包括选择合适的扩散池材质、优化接收液组成和控制防腐剂的透皮量。

扩散池材质需考虑防腐剂的吸附性：苯扎溴铵易吸附玻璃，可使用聚四氟乙烯（PTFE）材质；尼泊金酯类对塑料吸附性低，用聚丙烯（PP）材质。需验证材质对防腐剂的吸附率（<10%）。

优化接收液组成：若防腐剂在水中溶解度高，可加入少量有机溶剂（如10%乙醇）降低其溶解度；或选择与防腐剂极性相反的接收液，减少其在接收液中的积累。需维持“漏槽条件”。

控制防腐剂的透皮量：减少制剂涂药量（如从2mg/cm²减至1mg/cm²），或在皮肤表面覆盖微孔膜（阻挡防腐剂透过）。需验证微孔膜不影响药物透皮速率。

干扰排除方法的验证——方法学可靠性的确认

无论采用哪种方法，都需通过方法学验证确保结果可靠，主要指标包括回收率、精密度、准确性和专属性。

回收率实验：向已知浓度的药物溶液中加入不同浓度的防腐剂（低、中、高），处理后检测药物回收率（需85%-115%）。例如，药物浓度10μg/mL，加入1、10、100μg/mL防腐剂，回收率需在范围内。

精密度实验：同一操作者处理6份样品，计算药物浓度的相对标准偏差（RSD<10%）；不同操作者或设备处理的样品，RSD<15%。

准确性实验：用标准加入法，向实际样品中加入已知量的药物标准品，计算回收率（如加入5μg/mL药物，检测到4.8μg/mL，回收率96%）。

专属性实验：证明处理后防腐剂的信号完全消失或不影响药物检测。例如，HPLC色谱图中无防腐剂峰，或LC-MS/MS未监测到防腐剂的离子信号。