海水水样检测中溶解有机物的荧光光谱检测方法研究

海水中的溶解有机物（DOM）是海洋碳循环与生态系统功能的核心载体，其组成（如类腐殖质、类蛋白质）与含量直接关联海水水质、生物有效性及碳汇潜力。荧光光谱法因具备高灵敏度、非破坏性、多组分同时分析的特点，成为DOM检测的关键技术。本文聚焦海水DOM荧光光谱检测的原理、前处理、参数优化及干扰消除等核心环节，系统阐述方法细节，为技术落地提供科学依据。

荧光光谱法检测海水DOM的基本原理

海水中DOM的荧光特性源于两类荧光团：类腐殖质（如腐殖酸、富里酸）与类蛋白质（如酪氨酸、色氨酸）。类腐殖质依赖共轭芳香环结构，典型峰为A峰（Ex≈254nm/Em≈435nm，类富里酸）、C峰（Ex≈330nm/Em≈450nm，类腐殖酸）；类蛋白质则由氨基酸残基发色团主导，典型峰为B峰（Ex≈275nm/Em≈305nm，酪氨酸）、T峰（Ex≈280nm/Em≈340nm，色氨酸）。

激发-发射矩阵（EEM）荧光光谱是核心技术：通过连续扫描激发波长（Ex，200-400nm）与对应发射波长（Em，250-550nm），形成二维图谱。图谱中每个点的荧光强度与DOM浓度正相关，Ex-Em组合对应荧光团结构——例如T峰的Ex280nm/Em340nm直接指向色氨酸类蛋白质，C峰的Ex330nm/Em450nm对应类腐殖酸。

与单一波长检测相比，EEM光谱能捕获DOM的“荧光指纹”，实现多组分同时识别，是DOM检测的“黄金工具”。

海水DOM荧光检测的样品前处理技术

第一步是过滤：去除悬浮颗粒物与浮游植物，常用0.22μm聚醚砜（PES）膜（避免纤维素膜吸附类腐殖质），低压（<0.2MPa）过滤防止DOM变性，采样后2h内完成以避免浮游植物裂解。

第二步是富集：针对海水中DOM低浓度（0.5-5mg/L）的问题，用固相萃取（SPE）富集。HLB柱（亲水-亲脂平衡）为首选，活化需依次用5mL甲醇（润湿填料）、10mL超纯水（置换为水相）；样品过柱速度1-2mL/min确保吸附充分，洗脱用5mL甲醇，氮吹浓缩至1mL后待测。

第三步是除盐：海水高盐度（35‰）会导致荧光猝灭，用透析法（截留分子量1000Da）去除盐分，超纯水透析24h（每6h换水），确保电导率<10μS/cm。

海水DOM荧光检测的关键参数优化

扫描范围：Ex设为200-400nm（覆盖类腐殖质与类蛋白质的激发波长），Em设为250-550nm（覆盖主要荧光峰），避免遗漏关键信息。

狭缝宽度：Ex与Em狭缝均设为5nm——狭缝过宽（如10nm）会引入杂散光，导致峰形模糊；过窄（如2nm）则光通量不足，信号噪声大。

扫描速度：2400nm/min为最优——太快（如4800nm/min）会导致信号采集不充分，信噪比下降；太慢（如1200nm/min）则效率低下，无法满足批量样品需求。

PMT电压：设为400V左右——电压过高（如500V）会增加背景噪声，过低（如300V）则信号弱，需通过硫酸奎宁标准溶液（10μg/L）校准，确保荧光强度变异系数<5%。

海水DOM荧光检测的干扰因素及消除策略

叶绿素干扰：源于浮游植物，未过滤完全会释放细胞内蛋白质，导致T峰虚高。解决方法是严格0.22μm膜过滤，采样后尽快处理。

金属离子干扰：Fe³+、Cu²+通过络合降低荧光量子产率（如Fe³+使类腐殖质荧光下降30%-50%）。加入0.1mol/L EDTA（体积比1:100），络合金属离子以释放游离DOM。

散射干扰：瑞利散射（Ex=Em）与拉曼散射（Ex≠Em）会形成高强度峰，用空白扣除法消除——采集超纯水的EEM光谱，与样品光谱相减，需确保空白与样品的温度、pH一致。

pH干扰：类腐殖质在pH<5时荧光减弱，pH>7时增强。检测前用0.1mol/L HCl/NaOH调节pH至7.0±0.2，保持条件一致。

基于EEM光谱的海水DOM定性分析方法

平行因子分析（PARAFAC）是解析EEM光谱的主流方法，能从重叠峰中分离独立组分。其原理是将三维EEM数据（样品×Ex×Em）分解为三个矩阵：组分的Ex光谱、Em光谱、样品浓度矩阵，满足X=F×Cᵀ×E+残差（X为原始数据）。

步骤包括：1）数据预处理：去除Ex<220nm或Em<250nm的散射区域，用拉曼散射峰归一化（消除仪器波动）；2）模型验证：通过“折半分析”（将样品分为两组，对比组分光谱一致性，需>90%）确保可靠性；3）组分识别：将分解的Ex-Em光谱与标准谱库对比——例如组分1的Ex250nm/Em420nm对应类富里酸，组分2的Ex320nm/Em450nm对应类腐殖酸，组分3的Ex280nm/Em340nm对应色氨酸。

PARAFAC无需预先知道DOM组成，能客观反映真实组分，是国际海洋学委员会（IOC）推荐的标准方法。

海水DOM荧光检测的定量分析方法

外标法是常用的定量手段：选择与目标组分结构相似的标准物质——类腐殖质用国际腐殖酸协会（IHSS）的富里酸标准，类蛋白质用色氨酸/酪氨酸标准。

标准曲线绘制：配制5个浓度梯度（如色氨酸0.1、0.5、1、5、10mg/L），在对应荧光峰（如T峰Ex280nm/Em340nm）处测定荧光强度，以浓度为横坐标、荧光强度为纵坐标，拟合线性方程（R²需>0.99）。

样品定量：测定样品在目标峰的荧光强度，代入标准曲线计算浓度。需注意，富集后的样品需乘以富集倍数（如10倍），确保结果准确。

总荧光强度（TFI）是DOM总量的间接指标——计算EEM光谱中所有荧光点的强度之和，与DOM浓度正相关，适用于快速筛查。

海水DOM荧光检测的质量控制措施

空白样：用超纯水做空白，检查实验过程中的污染（如甲醇残留、滤膜吸附），空白的荧光强度需<样品的10%。

平行样：取同一海水样品做3次平行检测，相对标准偏差（RSD）需<5%，确保重复性。

加标回收：在样品中加入已知浓度的标准物质（如富里酸1mg/L），计算回收率（85%-115%为合格），验证方法准确性。

仪器校准：每周用硫酸奎宁标准溶液（10μg/L）校准荧光强度，确保仪器稳定性；每月清洗样品池（用甲醇超声10min），去除附着的DOM。