透皮吸收测试中透皮吸收实验的空白皮肤透皮背景值测定与扣除

透皮吸收测试是评估经皮给药系统（如软膏、贴片、凝胶）有效性的核心实验方法，其结果直接影响药物的临床应用评价。然而，实验中未接触药物的“空白皮肤”会向接收介质释放内源性成分或残留杂质，形成“透皮背景值”——若不准确测定并扣除这一数值，药物的实际透皮量会被虚高计算，导致实验结论偏差。本文结合透皮吸收实验的实际操作细节，系统阐述空白皮肤透皮背景值的测定逻辑与扣除要点，为实验可靠性提供关键支撑。

空白皮肤透皮背景值的定义与来源

空白皮肤透皮背景值，指未接触药物的正常皮肤在透皮实验条件下（如32℃、搅拌、特定接收液），向接收介质释放的物质总量。其来源主要分为四类：一是皮肤自身的内源性成分，如角质层脂质（神经酰胺、胆固醇）、表皮细胞代谢物（氨基酸、小分子肽）；二是皮肤表面污染物，如实验前未清洗干净的汗液、毛发碎屑、环境灰尘；三是皮肤保存过程引入的杂质，如冷冻保存时添加的二甲基亚砜（DMSO）、防腐剂；四是接收介质的空白信号，如磷酸盐缓冲液本身的紫外吸收或色谱峰。这些物质会干扰药物的定量分析（如HPLC峰重叠、UV吸光度干扰），因此必须通过空白实验分离。

需注意的是，空白皮肤的“空白”并非绝对——即使是新鲜健康的皮肤，也会因自身代谢或屏障功能轻微破坏释放少量物质。例如，小鼠皮肤的角质层脂质在32℃下会缓慢溶出到接收液中，若实验中使用紫外检测器（210nm），这些脂质会产生明显吸收峰，若不扣除，会被误算为药物透皮量。

空白皮肤样品的制备要点

空白皮肤的质量直接决定背景值的准确性，制备需严格控制以下环节：首先是皮肤来源，动物皮肤优先选择健康、无外伤的SD大鼠或小型猪（皮肤结构与人类更接近），人类皮肤需来自伦理批准的新鲜整形废弃组织（如腹部、大腿部）；其次是脱毛处理，需用电动剃毛器（避免脱毛膏破坏角质层），先剪短毛发至1-2mm再顺向剃除，剃后用生理盐水轻擦皮肤，检查有无划痕或红点（损伤皮肤会导致背景值骤升）；最后是保存，短期（<24小时）可4℃冷藏，长期需-80℃冷冻（分装成小块，避免反复冻融）。

例如，某实验使用大鼠皮肤时，若脱毛时用力过度导致皮肤出现微小划痕，后续实验中空白皮肤的背景值会比正常皮肤高3-5倍——这是因为划痕破坏了角质层屏障，皮肤内的蛋白质和脂质大量溶出到接收液中。

背景值测定的时机与操作流程

背景值必须与药物组“同步测定”——即使用同一批皮肤、相同实验条件（温度、搅拌速度、接收液体积）、同一时间点取样。具体流程如下：将空白皮肤固定在Franz扩散池的供给池与接收池之间（供给池为空或加空白介质），接收池加入新鲜接收液（如生理盐水或磷酸盐缓冲液，需与药物组一致），设置实验温度32℃（模拟人体皮肤表面温度）、搅拌速度300-500rpm（保证接收液均匀）；按照药物组的取样时间点（如1、2、4、6、8小时）采集接收液样品，每取一次补充等量新鲜接收液；样品经前处理（如过滤、液液萃取）后，用与药物检测完全相同的分析方法（如HPLC、UV）测定信号值（峰面积或吸光度）。

需强调的是，空白组的样本量需足够——每个实验条件至少设置3个平行空白皮肤，取平均值作为该条件下的背景值，以减少皮肤个体差异的影响。例如，若仅用1个空白皮肤，其背景值可能因皮肤本身的差异（如同一大鼠的背部与腹部皮肤脂质含量不同）导致误差，而3个平行样本的CV（变异系数）需控制在10%以内，否则需重新实验。

影响背景值准确性的关键因素

皮肤完整性是影响背景值的核心因素——若皮肤有破损（如划痕、烧伤），内源性成分会快速释放，背景值显著升高。实验前需用“电阻法”检查皮肤完整性：将电极插入供给池与接收池，测定皮肤的电阻值，健康大鼠皮肤的电阻通常>10kΩ·cm²，低于该值说明屏障功能破坏，需丢弃。

接收液的选择也会干扰背景值——例如，若接收液为含20%乙醇的磷酸盐缓冲液（用于增加脂溶性药物溶解度），乙醇会溶解皮肤表面的脂质，导致背景值比生理盐水高2-3倍。因此，接收液需满足“双低”要求：对皮肤成分的溶解度低、对药物检测的干扰低。实验前需做预实验：将空白皮肤浸泡在候选接收液中24小时，测定背景值，选择背景值最低且不影响药物溶解的接收液。

分析方法的特异性也很重要——例如，某药物的HPLC检测波长为254nm，而皮肤中的酪氨酸代谢物在254nm也有吸收，若色谱柱（如C18柱）无法将两者分离，会导致背景值虚高。解决方法是优化色谱条件：调整流动相比例（如增加乙腈含量）或更换色谱柱（如用苯基柱），使药物峰与皮肤成分峰的分离度>1.5。

背景值扣除的计算逻辑与注意事项

背景值扣除的核心是“对应时间点、对应条件”——即药物组每个时间点的测定值，减去同一时间点空白组的“净背景值”（空白皮肤背景值-接收液空白值）。计算步骤如下：首先测定“接收液空白”（未接触皮肤的新鲜接收液的信号值），然后计算空白皮肤的“总背景值”（空白皮肤+接收液的信号值），两者的差值即为“净背景值”；最后用药物组的信号值减去净背景值，得到药物的“实际信号值”，再换算成药物浓度或透皮量。

例如，某药物组在6小时时的HPLC峰面积为12000，同一时间点空白组的总背景值为1500，接收液空白值为300，则净背景值=1500-300=1200，药物的实际峰面积=12000-1200=10800，再根据标准曲线计算药物浓度。需注意，不能用“平均背景值”扣除所有时间点——例如，实验初期（0-2小时）皮肤表面的污染物快速溶出，净背景值可能为2.0μg/mL，而实验后期（12小时）皮肤内源性成分缓慢释放，净背景值可能降至0.5μg/mL，若用平均1.25μg/mL扣除所有时间点，会导致早期药物量虚低、后期虚高。

常见误差来源及规避方法

误差来源1：皮肤处理不当——如脱毛时用脱毛膏，导致角质层破坏，背景值高。规避方法：用电动剃毛器，先剪短毛发再剃，剃后检查皮肤有无损伤。

误差来源2：接收液未做空白——如某批次生理盐水含有微量有机物，导致接收液空白值高，未扣除会使净背景值虚高。规避方法：每批接收液都需做空白测定，记录信号值并扣除。

误差来源3：空白组与药物组皮肤不同批——如药物组用大鼠背部皮肤，空白组用腹部皮肤，背部皮肤的脂质含量比腹部高，导致背景值差异大。规避方法：空白组与药物组的皮肤需来自同一批（如同一大鼠的不同部位，或同一供体的人类皮肤），保证皮肤状态一致。

误差来源4：分析方法干扰——如药物峰与皮肤成分峰重叠，导致背景值无法准确测定。规避方法：优化分析方法，如HPLC中调整流动相的pH值（如从7.0调至5.0），使两者的保留时间差异增大，分离度提高。

实验中的“双空白”验证策略

为确保背景值测定的准确性，实验中需设置“双空白”：一是“接收液空白”（未接触皮肤的接收液），二是“空白皮肤+接收液空白”（接触空白皮肤的接收液）。通过双空白验证，可区分“接收液本身的干扰”与“皮肤释放的干扰”。例如，若接收液空白的信号值为0.05AU（UV），空白皮肤+接收液的信号值为0.30AU，则净背景值为0.25AU，说明0.25AU是皮肤释放引起的；若接收液空白的信号值为0.20AU，空白皮肤+接收液的信号值为0.30AU，则净背景值为0.10AU，说明大部分干扰来自接收液本身，需更换接收液批次。

此外，实验结束后需检查空白皮肤的状态——若空白皮肤出现肿胀、变色（如发白或发黄），说明实验条件不当（如温度过高、接收液pH不适），导致皮肤结构破坏，背景值不可靠，需重新实验。例如，若实验温度设置为37℃（而非32℃），空白皮肤的脂质会因温度过高加速溶出，背景值比32℃时高1.5倍，且皮肤会出现轻微肿胀，这种情况下的背景值不能用于扣除。